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口腔疾病防治 2024年第10期32卷 805-813页

作者：廖凌子宋雅朦刘美萱李思怡周平兰州大学口腔医学院甘肃兰州730000 甘肃省牙颌面重建与生物智能制造重点实验室甘肃兰州730000

骨骼疾病如骨质疏松、骨关节炎等已成为亟待解决的人类健康问题,细胞治疗及组织工程技术被认为是理想的治疗方法之一。人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)具备体外长期自我更新和分化所有三胚层来源体细胞... 详细信息

骨骼疾病如骨质疏松、骨关节炎等已成为亟待解决的人类健康问题,细胞治疗及组织工程技术被认为是理想的治疗方法之一。人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)具备体外长期自我更新和分化所有三胚层来源体细胞的独特功能,已成为目前最有前景的成骨细胞来源。因此,需要构建成分明确的hiPSCs体外成骨向诱导分化体系,获得符合临床应用要求的成骨样细胞。许多团队在促进hiPSCs向成骨分化成熟的直接路径和经间充质干细胞的间接路径方面取得了实质性的进展,本文针对这两类成骨分化路径及其应用现状进行综述,以期为骨再生技术提供参考。现有研究借助拟胚体法和单层诱导法,基于生物材料,构建可支持hiPSCs体外培养和成骨向诱导分化体系。然而,目前的研究主要存在成分不明确,分化效率低等局限,基于特定化合物严格调控的分阶段式和三维定向诱导体系是未来的主要研究方向。

关键词：骨再生人诱导多能干细胞成骨细胞诱导分化拟胚体法单层诱导法分阶段诱导法三维定向诱导体系

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利用成分明确诱导培养基和图案化表面将hiPSCs体外分化为间充质样细胞的研究

利用成分明确诱导培养基和图案化表面将hiPSCs体外分化为间充质样...

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作者：张鹏霞兰州大学

学位级别：硕士

背景:人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,h MSCs)可以来源于骨髓、脐带、脂肪等诸多组织,已广泛应用于再生医学、组织工程、细胞治疗等领域,但存在来源有限、体外扩增能力不足、复制性衰老等问题。人诱导多能干细胞(human in... 详细信息

背景:人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,h MSCs)可以来源于骨髓、脐带、脂肪等诸多组织,已广泛应用于再生医学、组织工程、细胞治疗等领域,但存在来源有限、体外扩增能力不足、复制性衰老等问题。人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hi PSCs)可以来源于患者自身细胞,具有无限增殖和多向分化潜能,且通过体外诱导分化能获得人诱导多能干细胞来源间充质样细胞(human induced pluripotent stem cells derived mesenchymal stem cells,hi PSCs-MSCs)。遗憾的是,现有诱导分化方法多直接使用含血清的间充质培养基,存在成分不明确、诱导分化率低等问题。更为重要的是,间充质细胞缺乏特异性标志物,连续传代导致细胞衰老,亟需开发有效的细胞纯化方法。方法:采用广泛使用的拟胚体诱导方法,将hi PSCs体外分化为间充质样细胞。以含血清拟胚体培养基为对照,将hi PSCs来源拟胚体转移至超低粘附板中并使用成分明确的E6培养基培养5天。利用CCK8、RT-PCR和流式细胞术等方法,研究不同阶段添加功能化合物TGF-β和RA对细胞存活和间充质向分化效率的影响。确定理想的悬浮培养基后,使用成分明确的间充质培养基进行10天的贴壁培养。以Matrigel为对照,对比不同成分明确培养表面(明胶或多肽修饰表面)对拟胚体细胞生长和间充质分化效率的影响。然后,制备不同宽度(0μm,5μm,10μm,20μm,40μm)的聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxan,PDMS)微图案化表面,并利用聚N-异丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide)PNIPAAm)温敏涂层和明胶进行修饰。使用X射线光电子能谱(XPS),原子力显微镜(AFM),水接触角等方法进行表征。继而,将上述表面获得的间充质样细胞,以单细胞接种至微图案化表面,研究沟槽宽度对hi PSC-MSCs的纯化作用。最后,将获得的hi PSCs-MSCs进行细胞鉴定,并且与脐带来源的成体间充质干细胞(h UMSCs)进行增殖能力以及多潜能分化鉴定对比。结果:拟胚体悬浮培养5天,在后3天(D3-D5阶段)使用添加功能化合物40ng/m L RA的E6培养基,可以促进中胚层和间充质向分化。贴壁培养阶段,RT-PCR显示明胶表面CD73、CD44、CD29、CD45、CD90和CD105基因表达量高以及流式细胞术显示明胶表面CD73和CD44阳性表达量最高,确定明胶修饰表面为理想表面。然后,AFM证实成功获得了不同宽度的沟槽图案化表面。XPS全谱图观察到酰胺键C=O伸缩振动的特征吸收峰,显示成功制备了温敏涂层。细胞实验证实,相比于胰酶消化,温敏涂层可以显著地提高细胞的存活率。更为重要的是,培养在20μm宽度表面的细胞,呈现均一的间充质样细胞形貌以及高表达CD73、CD44、CD29、CD45、CD90和CD105间充质标记物。最后,获得的CD73CD44hi PSCs-MSCs,具有与h UMSCs相当的体外扩增和多潜能分化能力。结论:本研究利用拟胚体法和成分明确培养基,成功构建hi PSCs-MSCs体外诱导分化培养体系。而且,利用温敏涂层微图案化表面机械性“接触引导”促进hi PSCs-MSCs的纯化,高效率获得可用于临床的间充质样细胞。本项目结果有助于推进hi PSCs-MSCs在组织工程、修复、基因治疗和细胞移植等领域的应用,具有较大的科学研究意义和经济价值。

关键词：人诱导多能干细胞间充质样细胞拟胚体法成分明确图案化表面温敏涂层

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人诱导多能干细胞向成骨样细胞逐步诱导分化的研究

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作者：韩雨兰州大学

学位级别：硕士

骨组织是人体行使运动、支撑、保护等功能的重要组成部分,但由外伤、感染、肿瘤和先天性疾病等因素造成的不同类型的骨缺损却非常常见,且是临床治疗中的难点之一,同样颌骨的缺损也一直是口腔外科、种植修复所面临的一大难题。目前,为解... 详细信息

骨组织是人体行使运动、支撑、保护等功能的重要组成部分,但由外伤、感染、肿瘤和先天性疾病等因素造成的不同类型的骨缺损却非常常见,且是临床治疗中的难点之一,同样颌骨的缺损也一直是口腔外科、种植修复所面临的一大难题。目前,为解决骨的来源、排异反应及力学要求等问题,骨组织再生工程成为解决骨缺损修复临床治疗问题的有效途径之一。其中,骨组织工程的关键因素是成骨细胞,成骨细胞是骨形成的基础细胞,如何获得足够数量的成熟的成骨细胞也就成为目前骨组织工程在基础研究和临床应用中的关注重点。人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)具有和人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)一样的多能性,能进行无限增殖和分化为三胚层中的各种体细胞,且hiPSCs是由人体体细胞重编程获得的,避免了hESCs存在的伦理问题,在组织发育、药物筛选和细胞疗法等领域显示出良好的应用前景。因此本课题的主要研究目的是高效率诱导hiPSCs分化为成骨样细胞,为骨组织工程提供足够数量的高质量的种子细胞。针对目前hiPSCs成骨向诱导方法起始分化条件不一致的问题,本课题分别探究了拟胚体(embryoid bodies,EBs)诱导法的最佳悬浮培养时间和单层诱导法的理想起始分化细胞密度。首先,将hiPSCs来源的EBs悬浮培养3-10天,利用RT-PCR技术分析了中胚层、神经嵴、间充质及成骨相关基因在这些样本中的表达。然后,选取悬浮时间为3天、5天、7天和10天的EBs,将其接种于明胶表面并利用成骨诱导培养基诱导分化14天,最后利用RT-PCR技术、碱性磷酸酶实验、茜素红实验及免疫荧光技术比较成骨分化效率。结果表明,3-5天是通过拟胚体法进行成骨向诱导分化的最佳悬浮时间。此外,当hiPSCs在Matrigel表面汇合到不同的细胞密度(20%、50%、80%和100%)时,采用单层诱导法进行7天、14天、21天和28天的成骨向分化,并利用上述方法分析成骨分化效率,结果表明80%起始分化密度适于单层成骨诱导分化。上述结果为接下来继续利用单层法诱导hiPSCs定向成骨分化体系的构建奠定了基础。最后,通过查阅文献,针对在胚胎向中外胚层分化过程中起重要作用的信号通路,选择CHIR99021、CYC、FGF2、SB431542、LY294002和BMP4等相关化合物,构建体外hiPSCs经中外胚层向成骨样细胞分化的诱导体系。同时,借鉴诱导hPSCs经中胚层定向诱导分化为心肌细胞的经验及逐步诱导hPSCs成骨分化的研究,将诱导hiPSCs中胚层向分化时间分为2天(D0-D2阶段)和5天(D3-D5阶段)。首先,当hPSCs在Matrigel表面汇合到80%的细胞密度时,利用上述化合物分别进行2天的中胚层向诱导,并利用RT-PCR技术检测中胚层及成骨相关基因的表达。随后,利用成骨诱导培养基继续诱导其分化14天并检测成骨分化效率。结果显示:CHIR99021和SB431542是D0-D2阶段的最有效的化合物。在确定前2天条件的基础上,继续利用上述化合物分别进行3天的中外胚层向诱导,利用RT-PCR技术检测中胚层、神经嵴、间充质及成骨相关基因的表达,并分析继续成骨分化14天后的成骨效率,确定了D3-D5阶段最有效的化合物为BMP4。后期,将继续探索小分子诱导中外胚层样细胞向间充质样细胞分化,继而向成骨样细胞分化,最终实现高效率的hiPSCs成骨分化,对继续构建成分明确的hiPSCs定向成骨分化诱导体系具有重要意义。

关键词：人诱导多能干细胞成骨分化拟胚体法悬浮时间细胞密度中外胚层

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