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拟核结合蛋白与细菌基因的表达调控

中国生物化学与分子生物学报 2011年第5期27卷 403-411页

作者：樊祥宇王洪海谢建平西南大学生命科学学院三峡库区生态环境和生物资源国家重点实验室培育基地现代生物医药研究所重庆400715 复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

拟核结合蛋白是细菌遗传物质组织和基因表达调控的关键.细菌基因组压缩为致密的拟核必需有拟核结合蛋白的支撑.拟核结合蛋白、DNA超螺旋和大分子簇在拟核的结构形成中起到重要作用,其中拟核结合蛋白最重要.拟核结合蛋白还影响细菌DNA的... 详细信息

拟核结合蛋白是细菌遗传物质组织和基因表达调控的关键.细菌基因组压缩为致密的拟核必需有拟核结合蛋白的支撑.拟核结合蛋白、DNA超螺旋和大分子簇在拟核的结构形成中起到重要作用,其中拟核结合蛋白最重要.拟核结合蛋白还影响细菌DNA的复制、重组、转录和修复等多个重要生理过程.作为全局调控因子,拟核结合蛋白是调控细菌适应环境变化所需基因表达的关键.本文总结拟核结合蛋白的结构、功能和调控,特别是其在致病与非致病分枝杆菌中的差别,为寻找新药物靶标提供线索.

关键词：拟核结合蛋白拟核转录调控

玫瑰孢链霉菌拟核结合蛋白Lsr2的功能研究

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玫瑰孢链霉菌拟核结合蛋白Lsr2的功能研究

作者：沈兰西南大学

学位级别：硕士

背景:Streptomyces roseosporus NRRL 15998是礼来公司的研究人员从土耳其亚拉腊山的土壤中分离得到的一株产孢放线菌。因其能产生临床重要抗生素达托霉素而受到广泛重视。达托霉素是新型脂肽类抗生素中的一种,经FDA批准可用于治疗复杂... 详细信息

背景:Streptomyces roseosporus NRRL 15998是礼来公司的研究人员从土耳其亚拉腊山的土壤中分离得到的一株产孢放线菌。因其能产生临床重要抗生素达托霉素而受到广泛重视。达托霉素是新型脂肽类抗生素中的一种,经FDA批准可用于治疗复杂的皮肤和软组织感染,以及由金黄色葡萄球菌感染导致的菌血症和心内膜炎。然而由于S.roseosporus发酵获得的达托霉素产量很低,因此改造玫瑰孢链霉菌以提高达托霉素的产量至关重要。拟核结合蛋白最早在大肠杆菌中被发现。目前已经确定的链霉菌中的拟核结合蛋白主要包括HupA、HupS、s IHF、Crp、DpsA和DpsC,以及BldD等。这些拟核结合蛋白在链霉菌的发育分化和次级代谢产物合成方面发挥重要功能,例如hupA和hupS敲除突变株孢子中的拟核增大;sihf突变株存在产孢缺陷,十一烷基灵菌红素(Red)和放线紫红素(Act)产量提高;dps突变株孢子中的拟核发生不规则压缩;crp突变株的放线紫红素、十一烷基灵菌红素和钙依赖抗生素(CDA)的产量显著下降,未知结构的化合物产生;bldD突变株气生菌丝形成受阻,孢子分化障碍,抗生素产量显著下降。分枝杆菌的拟核结合蛋白Lsr2,是H-NS样DNA桥连蛋白,与H-NS相比序列和结构不相似,但其功能相同,可互补hns的突变。Lsr2通过结合并桥连DNA,实现调控基因转录,压缩拟核等功能。通过生物信息学分析,在S.roseosporus NRRL 15998中发现2个Lsr2蛋白,但其功能未知。根据分枝杆菌Lsr2的现有研究,推测S.roseosporus NRRL 15998的Lsr2参与发育分化和次级代谢产物的生物合成调控,研究其调控机制,可为改造玫瑰孢链霉菌提供重要理论依据,为提高已有抗生素产量和激活隐性抗生素生物合成基因簇打下基础。目的:本文旨在探究s.roseosporusnrrl15998中拟核结合蛋白lsr2的功能,包括对s.roseosporus发育分化和次级代谢产物生物合成的影响,为解析lsr2在链霉菌中的作用机制和提高已有抗生素产量与激活沉默基因簇提供重要的依据。方法:1.生物信息学分析s.roseosporusnrrl15998的基因组序列,初步确定基因组中与编码分枝杆菌拟核结合蛋白lsr2对应的同源蛋白的基因lsr2和lsr22。2.为探究s.roseosporusnrrl15998中lsr2和lsr22的功能,构建fosmid文库。以文库质粒出发构建敲除载体,进而构建lsr2和lsr22基因敲除株Δlsr2、Δlsr22和Δlsr2/Δlsr22。以pset152质粒出发,构建过表达载体,进而构建lsr2和lsr22的遗传互补株(cm)和过表达株(oe)。3.为探究lsr2和lsr22在发育分化方面的功能,在不同的培养基和不同盐离子培养基的培养条件下,观察野生型和各突变株的菌丝和孢子的发育。通过midi脂肪酸检测系统测定敲除株的脂肪酸成分和含量,确定lsr2对脂肪酸合成和代谢的影响。4.为研究lsr2和lsr22对次级代谢产物生物合成的影响,发酵突变株、互补和过表达菌株,进行藤黄微球菌、铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌的生物活性测定。再利用半定量rt-pcr检测野生型和敲除株基因簇的表达,进一步通过转录组和生物信息学分析,探究转录水平变化。5.为验证lsr2和lsr22的dna结合能力,异源表达蛋白,以基因簇上基因片段为探针,采用emsa进行验证。结果:1.确定并成功克隆了分枝杆菌lsr2对应于s.roseosporus的2个lsr2基因,分别为lsr2(ssgg2869)和lsr22(ssgg3199)。2.成功构建了s.roseosporusnrrl15998fosmid文库,且文库遗传稳定性和插入片段随机性良好。3.利用fosmid文库构建了lsr2敲除载体pfoslsr2ko,基于pkc1139构建了lsr22敲除载体pkc1139-lsr22,同时基于pset152构建了lsr2过表达载体pset152kan-lsr2和lsr22的过表达载体pset152-lsr22。接合转移几个载体到野生型中成功获得了lsr2和lsr22基因敲除株(Δlsr2和Δlsr22)、遗传互补株(lsr2cm和lsr22cm)、过表达株(lsr2oe和lsr22oe)和双敲除株(Δlsr2/Δlsr22)。4.在几种不同的培养基上培养野生型和单双敲除株。Δlsr2在本研究中采用的多种培养基上培养时,菌丝呈红色且生长延迟,产孢受阻。在不加钠盐的as-i培养基中加入0.25m的其他金属离子后,敲除株的产孢能力有一定程度的恢复。Δlsr22不管是菌丝发育还是次级代谢方面,几乎没有发生表型变化。但两个基因都敲除后,表型改变的程度大于lsr2单敲除。5.MIDI脂肪酸检测系统检测了野生型和单双敲除株菌体的脂肪酸成分及其含量,与野生型

关键词：玫瑰孢链霉菌拟核结合蛋白 lsr2 隐性基因簇

耻垢分枝杆菌转录因子Ms6174广泛调控功能的鉴定及其调控生物被膜形成的机理研究

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基因组学与应用生物学 2022年第11期41卷 2144-2155页

作者：王瑞王坤郑慧霞张景馨金梅李伟辉亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004 广西大学生命科学与技术学院南宁530004

在前期研究中,利用耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)转座插入突变体文库筛选并鉴定到的转录因子的编码基因ms6174突变后影响了其细菌菌落表面形态。利用凝胶阻滞迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和β-半乳糖... 详细信息

在前期研究中,利用耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)转座插入突变体文库筛选并鉴定到的转录因子的编码基因ms6174突变后影响了其细菌菌落表面形态。利用凝胶阻滞迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和β-半乳糖苷酶活性实验证实了Ms6174直接负调控其自身所在基因簇的表达。同时,利用EMSA实验、DNaseⅠ酶切实验以及蛋白质与染色质DNA荧光共定位等实验发现Ms6174具有拟核结合蛋白的特性,即Ms6174是耻垢分枝杆菌中新的拟核结合蛋白。进一步通过转录组测序分析发现,相较于耻垢分枝杆菌野生型菌株,ms6174敲除菌株中有682个基因的表达水平发生了显著变化,其中有387个基因上调表达,295个基因下调表达,142个脂质代谢相关基因的表达水平发生变化。最后,检测并比较了耻垢分枝杆菌ms6174敲除突变体菌株与野生型菌株的菌落形态与生物被膜形成的差异,发现敲除ms6174后耻垢分枝杆菌的菌落表面褶皱与气液表面生物被膜增多,因此,转录因子Ms6174负调控耻垢分枝杆菌生物被膜的形成。综上,本研究鉴定了分枝杆菌中一个新的拟核结合蛋白Ms6174,其通过调控耻垢分枝杆菌脂代谢相关基因的表达而影响细菌生物被膜的形成。本研究为发掘新的广泛调控因子拟核结合蛋白提供了基础,为解析分枝杆菌生物被膜形成的调控机理提供了依据。

关键词：耻垢分枝杆菌转录调控拟核结合蛋白生物被膜

转录因子Ms6174的广泛调控功能鉴定及其调控耻垢分枝杆菌生物被膜形成的机理研究

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转录因子Ms6174的广泛调控功能鉴定及其调控耻垢分枝杆菌生物被膜...

作者：王瑞广西大学

学位级别：硕士

分枝杆菌是一大类细胞壁中富含脂质的革兰氏阳性细菌,其中最为知名的是引起人类结核病的结核分枝杆菌与其模式菌株耻垢分枝杆菌等。细菌生物被膜是由胞外基质如脂质、多糖、DNA和蛋白质等包裹的细菌群体,它的形成对病原细菌的抗逆性和... 详细信息

分枝杆菌是一大类细胞壁中富含脂质的革兰氏阳性细菌,其中最为知名的是引起人类结核病的结核分枝杆菌与其模式菌株耻垢分枝杆菌等。细菌生物被膜是由胞外基质如脂质、多糖、DNA和蛋白质等包裹的细菌群体,它的形成对病原细菌的抗逆性和致病性等具有重要的影响。分枝杆菌生物被膜的形成与其细胞壁脂质成分密切相关。然而,目前关于分枝杆菌细胞壁脂质代谢影响细菌生物被膜形成的调控机理还很不清楚,相关的调控因子还知之甚少。本论文以结核分枝杆菌模式菌株耻垢分枝杆菌为研究对象,鉴定了一个广泛调控功能的转录因子Ms6174,且其具有拟核结合蛋白的特性,同时还发现Ms6174通过调控多个脂质代谢相关基因的表达进而负调控分枝杆菌生物被膜的形成。具体取得的研究结果如下:(1)研究前期我们利用耻垢分枝杆菌转座插入突变体文库筛选并鉴定到转录因子的编码基因ms6174影响细菌的菌落表面形态。通过克隆、蛋白质表达与纯化获得了转录因子Ms6174的蛋白质。随后,利用凝胶阻滞迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测到Ms6174直接结合自身所在基因簇的启动子,具有自调控能力。进一步,构建了耻垢分枝杆菌ms6174的敲除菌株,运用β-半乳糖苷酶活性实验发现Ms6174负调控其自身所在基因簇的表达。(2)利用EMSA实验、DNaseⅠ酶切实验以及蛋白质与染色质DNA荧光共定位等实验发现Ms6174具有拟核结合蛋白的性质,即Ms6174是耻垢分枝杆菌中新的拟核结合蛋白。(3)通过转录组测序分析发现,相较于耻垢分枝杆菌野生型菌株,ms6174敲除菌株中有682个基因的表达水平发生了显著变化,其中有387个基因上调表达,295个基因下调表达,142个脂质代谢相关基因的表达水平发生变化。以上的结果说明Ms6174是一个广泛调控因子,可调控多个分枝杆菌脂质代谢基因的表达。(4)检测并比较了耻垢分枝杆菌ms6174敲除菌株与野生型菌株的菌落形态与生物被膜形成的差异,发现敲除ms6174后,耻垢分枝杆菌的菌落表面褶皱与气液表面生物被膜增多。由此可知,转录因子Ms6174负调控耻垢分枝杆菌生物被膜的形成。综上所述,本研究发现了耻垢分枝杆菌中一个广泛调控功能的转录因子Ms6174。首先,鉴定了转录因子Ms6174的自调控功能,并发现其具有拟核结合蛋白的特性。其次,通过转录组学分析发现了Ms6174具有广泛调控功能。最后,发现Ms6174负调控分枝杆菌生物被膜的形成,并推测其通过调控脂质代谢相关基因的表达进而调控细菌生物被膜的形成。研究结果为分枝杆菌的拟核结合蛋白家族增加了新成员,并加深了我们对分枝杆菌生物被膜形成调控机理的认识。

关键词：耻垢分枝杆菌转录调控拟核结合蛋白脂质代谢生物被膜

链霉菌形态分化与次级代谢产物合成的研究进展

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微生物学报 2021年第12期61卷 3870-3886页

作者：薛正莲王珊孙俊峰王芳周健安徽工程大学生物与化学工程学院微生物发酵安徽省工程研究中心安徽省工业微生物分子育种工程实验室安徽芜湖241000

链霉菌是一类具有复杂的形态分化周期和强大的次级代谢能力的高GC含量的放线菌,能够利用其初级代谢产生的前体化合物和能量,合成多种结构复杂、功能多样的具有生物活性的次级代谢产物,在农业、食品、畜牧业、工业以及医药研究等领域都... 详细信息

链霉菌是一类具有复杂的形态分化周期和强大的次级代谢能力的高GC含量的放线菌,能够利用其初级代谢产生的前体化合物和能量,合成多种结构复杂、功能多样的具有生物活性的次级代谢产物,在农业、食品、畜牧业、工业以及医药研究等领域都具有重要的价值。在链霉菌的形态分化后期常常伴随着次级代谢产物的生物合成,并且两者都受到复杂的网络调控;同时链霉菌的形态对次级代谢产物的产量和种类造成很大影响。对链霉菌生长周期的全面理解将加深对链霉菌形态分化与次级代谢产物合成关系的认识。本文将对链霉菌的形态分化过程、形态分化和抗生素合成两者共同的调控因子以及链霉菌形态与抗生素产量之间的关系进行综述,这将有助于理解抗生素的合成过程,也将会在缩短发酵周期、构建高产工程菌株、新型杀菌剂的研发以及新型抗生素的合成等方面给予我们启发。

关键词：链霉菌形态分化次级代谢拟核结合蛋白双组分调控