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携带CD163报告载体的猪诱导多能干细胞株的建立

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生物工程学报 2023年第1期39卷 192-203页

作者：岳威张炬庆吴晓龙杨昕淳沈巧艳于帅祝振硕王承宝张仕强华进联西北农林科技大学动物医学院、陕西省干细胞工程技术研究中心陕西杨凌712100 西北农林科技大学动物医学院预防兽医系陕西杨凌712100

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)是包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在内的多种高致病病毒的受体细胞,是研究病毒与宿主互作机制的重要模型。然而PAM来源有限... 详细信息

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)是包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在内的多种高致病病毒的受体细胞,是研究病毒与宿主互作机制的重要模型。然而PAM来源有限,难以满足当前需求。利用猪诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向巨噬细胞定向诱导是解决PAM细胞数量不足的有效方法。CD163是PAM细胞的重要标记,也是PRRSV等病毒的主要受体。建立实时报告CD163激活程度的报告系统对于建立并优化猪iPSCs向PAM的诱导分化体系具有指导意义。本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统,设计靶向CD163终止密码子的sgRNA并构建相应的打靶载体,将其导入到猪PAM中的检测报告系统。进一步将该报告系统导入猪iPSCs中,通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色和EDU染色等手段来检测其安全性。将猪内源CD163的报告载体系统转染至原代PAM中,检测到了红色荧光的表达,证明了该载体系统的可靠性;将CD163-reporter系统转染至猪iPSCs中,获得CD163 reporter-iPSCs。结果表明,CD163 reporter-iPSCs可以维持正常的多能性基因的表达,并具有与正常猪iPSCs一致的克隆形态和增殖能力。证实成功构建了CD163的报告载体,并将其转染至猪iPSCs,获得含有CD163报告载体的猪iPSCs系。该报告载体既不影响猪iPSCs的多能性,又能够实时指示CD163的表达,为深入解析猪iPSCs分化为PAM的机制以及解析PRRSV等重大病原与宿主的互作研究奠定了基础。

关键词： CD163 猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导多能干细胞报告载体 CRISPR/Cas9 猪

人SMYD3基因启动子荧光素酶报告载体的构建与分析

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中国药科大学学报 2009年第2期40卷 173-177页

作者：谢景航邹佳宁唐聪杨家森罗学刚奚涛中国药科大学生命科学与技术学院南京210009

目的:克隆5′长度不同的SMYD3基因启动子序列并进行活性鉴定。方法:采用PCR方法克隆出SMYD3基因转录起始位点上游不同长度的基因片段,构建T载体并利用酶切与测序进行鉴定;将该基因亚克隆至pGL3-Basic荧光报告基因载体上;瞬时转染Hep3B... 详细信息

目的:克隆5′长度不同的SMYD3基因启动子序列并进行活性鉴定。方法:采用PCR方法克隆出SMYD3基因转录起始位点上游不同长度的基因片段,构建T载体并利用酶切与测序进行鉴定;将该基因亚克隆至pGL3-Basic荧光报告基因载体上;瞬时转染Hep3B细胞后用双荧光报告检测系统检测不同片段的荧光活性。结果:T载体酶切与测序结果正确,成功构建了pGL3-Basic+370～1400bp荧光报告载体并利用双荧光素酶报告基因检测系统分析了重组质粒的荧光活性。结论:pGL3-Basic+370～1400bp重组质粒转染组与阳性对照组相比并未表现出显著的荧光活性,本研究认为SMYD3基因的启动子核心区域位于-1334bp的上游。

关键词： SMYD3 荧光素酶报告载体启动子

小鼠Omi/HtrA2基因启动子萤光素酶报告载体的构建及转录活性分析

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中国病理生理杂志 2015年第10期 1907-1908页

作者：刘丹武烨刘鑫刘慧荣首都医科大学

目的:通过构建小鼠Omi/HtrA 2基因启动子萤光素酶报告载体并进行转录活性分析,深入研究小鼠Omi/HtrA 2转录调控发生的机制。方法:本实验构建覆盖小鼠Omi/HtrA 2基因5’侧翼区（-1 205 bp;93 bp）区域的一系列启动子萤光素酶报告基因载体... 详细信息

目的:通过构建小鼠Omi/HtrA 2基因启动子萤光素酶报告载体并进行转录活性分析,深入研究小鼠Omi/HtrA 2转录调控发生的机制。方法:本实验构建覆盖小鼠Omi/HtrA 2基因5’侧翼区（-1 205 bp;93 bp）区域的一系列启动子萤光素酶报告基因载体,将其转染至小鼠成纤维细胞NIH3T3、大鼠心肌细胞H9c2和人胚肾细胞HEK293,并进行萤光素酶活性检测。结

关键词：报告载体 Omi/HtrA2 小鼠小家鼠转录活性萤光素酶基因启动子

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维生素D_3对报告载体荧光素酶表达的作用

营养学报 1999年第4期21卷 414-417页

作者：庞智 JulianRFWalters 苏州市消化系疾病与营养研究中心苏州215008 英国伦敦皇家医学研究生院

目的：　研究１，２５－二羟维生素Ｄ３对结肠癌细胞系Ｃａｃｏ－２细胞中报告基因表达的作用，并探讨在报告载体ｐＧＬ２序列中存在潜在的抑制性维生素Ｄ应答元件（ＶＤＲＥ）的可能性。方法：　采用磷酸钙沉淀法将报告载体转染入... 详细信息

目的：　研究１，２５－二羟维生素Ｄ３对结肠癌细胞系Ｃａｃｏ－２细胞中报告基因表达的作用，并探讨在报告载体ｐＧＬ２序列中存在潜在的抑制性维生素Ｄ应答元件（ＶＤＲＥ）的可能性。方法：　采用磷酸钙沉淀法将报告载体转染入Ｃａｃｏ－２细胞。Ｃａｃｏ－２细胞经不同浓度１，２５－二羟维生素Ｄ３处理后测定细胞裂解液中表达的荧光素酶活性。结果：　应用ｐＧＬ２报告载体时，当用ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染后，１，２５－二羟维生素Ｄ３显著地抑制Ｃａｃｏ－２细胞荧光素酶的表达（Ｐ＜０．０５）；而未使用该表达载体共转染则无抑制作用（Ｐ＞０．０５）。应用ｐＧＬ３报告载体时，不同浓度的１，２５－二羟维生素Ｄ３对ｐＬＧ３转染后Ｃａｃｏ－２细胞表达的荧光素酶活性均无显著抑制作用（Ｐ＞０．０５），该作用不依赖是否存在有ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染。结论：１，２５－二羟维生素Ｄ３对报告载体ＰＧＬ２荧光素酶表达具有抑制作用，而对ｐＧＬ３则否；类似人类ＰＴＨ基因中的潜在抑制性ＶＤＲＥ存在于报告载体ｐＧＬ２，在ｐＧＬ３中该ＶＤＲＥ业已改变。

关键词：维生素D3 Gaco-2细胞报告载体荧光素酶活性

人白细胞介素6基因启动子报告载体的构建及作用检测

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人白细胞介素6基因启动子报告载体的构建及作用检测

作者：吕文军中国医科大学

学位级别：硕士

目的骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的,致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。骨质疏松症是严重影响人们生活质量的常见病,其防治工作任重道远。骨质疏松症的致病机制在于骨代谢... 详细信息

目的骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的,致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。骨质疏松症是严重影响人们生活质量的常见病,其防治工作任重道远。骨质疏松症的致病机制在于骨代谢和骨重建过程的失衡,破骨细胞(Osteoclast,OC)的骨吸收作用大于成骨细胞(Osteoblast,OB)的骨形成所致。雌激素是影响骨代谢平衡的一个重要监控子,其主要作用是抑制OB分泌白细胞介素1和白细胞介素6(interleukin-1,IL-6)等,进而使这些细胞因子所诱导的OC分化成熟减慢。雌激素替代疗法(Estrogen replace treatment,ERT)是治疗体内雌激素水平下降所致的绝经后骨质疏松症(post-menopausal osteoporosis,PMOP)的首选方案。 IL-6被认为是启动OC分化成熟的最重要细胞因子和病理条件下调节骨吸收的关键因子,在PMOP的发病机制中起着重要作用。IL-6与其受体结合可直接促进OC前体增殖分化,并使OB分泌更多的IL-6,从而进一步加强破骨作用。雌激素缺乏可导致体内IL-1和TNF-α水平增高,二者刺激OB分泌大量IL-6,诱导OC破骨活性增强。另一方面,雌激素受体还直接作用于IL-6启动子,抑制IL-6的表达。由此可见,IL-6是雌激素作用途径中的关键靶点,能直接反映雌激素抗骨质疏松的综合药效。因此,本研究以雌激素对IL-6基因转录调控作用为切入点,构建了人IL-6基因启动子报告载体,并与人雌激素受体表达载体共转染小鼠成骨样细胞,检测雌激素作用和IL-1诱导对这一报告载体转录活性的影响,为建立雌激素类抗骨质疏松症药物的分子生物学药效评价方案奠定基础。

关键词：白细胞介素6基因骨质疏松症启动子雌激素报告载体成骨细胞破骨细胞

牛精原干细胞的分离培养与标记基因PLZF报告载体的构建

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牛精原干细胞的分离培养与标记基因PLZF报告载体的构建

作者：闫慧敏内蒙古大学

学位级别：硕士

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是一种既具有自我更新能力又能定向分化为精子的雄性生殖干细胞,对于维持精子持续发生起着至关重要的作用。由于SSCs数量稀少,在细胞种类较多的睾丸细胞中占比极低,使SSCs的分离纯化和体外... 详细信息

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是一种既具有自我更新能力又能定向分化为精子的雄性生殖干细胞,对于维持精子持续发生起着至关重要的作用。由于SSCs数量稀少,在细胞种类较多的睾丸细胞中占比极低,使SSCs的分离纯化和体外培养等研究带来极大困难。目前关于人和模式动物小鼠SSCs的体外分离、培养、鉴定和分子标记等的研究已日渐成熟,而家畜大动物牛的研究还处于初级阶段。本研究尝试分离培养新生牛的SSCs(bovine SSCs,b SSCs),对b SSCs的形态、增殖特点、特异性分子标记等方面展开深入研究,以期获得纯度较高的b SSCs细胞系,并建立SSCs标记基因早幼粒细胞白血病锌指(promyelocytic leukemia zinc finger,PLZF)蛋白的报告载体,为探究牛精子发生机制、育种和基因改良等方面的研究提供模型和参考。我们选择新生牛作为睾丸采集对象,通过机械法和两步酶消化法获得睾丸的单细胞悬液,经过差速贴壁法对b SSCs进行纯化和分离,将获得的克隆团接种于铺有多聚赖氨酸的培养皿中进行长期培养,我们通过q-PCR和免疫荧光染色实验鉴定了标记基因在b SSCs中的表达,结果显示,与牛胎儿成纤维细胞(bovine fatal fibroblasts cells,BFFs)相比,标记基因CD9、UCHL1、ITGA6和DAZL在b SSCs中显著性升高;免疫荧光结果显示PLZF、UCHL1、GFRA1、DAZL、DDX4、NANOG蛋白在b SSCs中表达呈阳性。此外,我们还对b SSCs进行了转录组测序分析,结果显示,与精子相比b SSCs差异基因数目最多。GO富集分析显示,b SSCs差异基因主要富集在代谢相关的生物学过程,细胞膜、核糖体等组分,细胞骨架蛋白结合、肽生物合成等生物功能。KEGG富集分析显示,与永生化b SSCs比较,b SSCs差异基因主要富集在与细胞周期和细胞增殖相关途径;与牛的精子和睾丸相比,b SSCs差异基因主要富集在细胞代谢和与精子发生有关信号通路。我们还富集了在b SSCs和永生化b SSCs中高表达的基因,发现b SSCs选择性高表达特异性标记基因ITGA6、ITGB1、CD9、UCHL1和PLZF等。这为研究其他大动物家畜SSCs的标记基因提供参考。PLZF是SSCs的重要标记基因之一,为了监测牛多能干细胞(bovine pluripotent stem cells,b PSCs)向b SSCs分化的过程,我们设计构建与PLZF共表达增强型绿荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的报告系统。我们将由CRISPR/Cas9表达载体和EGFP供体质粒组成的双质粒报告系统通过电穿孔的方式共转染到b SSCs中,48 h后我们在暗视野中观测到表达绿色荧光的细胞。此外,我们还将该报告系统共转染到BFFs中并进行跨臂PCR检测,在琼脂糖凝胶电泳结果中我们获得了大小正确的目的条带。以上结果表明我们成功构建了SSCs标记基因PLZF报告体系,为b PSCs向b SSCs定向诱导分化体系的筛选和优化提供了有力的工具。

关键词：牛精原干细胞 PLZF 转录组测序报告载体 CRISPR/Cas9

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酿酒酵母乙醇响应报告载体的构建和研究

酿酒酵母乙醇响应报告载体的构建和研究

作者：张秋美大连理工大学

学位级别：硕士

乙醇对酵母细胞的生长和代谢都具有较强的抑制作用,对酿酒酵母乙醇耐性的分子机制研究可为选育具有较强乙醇耐受性的酵母菌种提供理论基础。本文扩增了絮凝酵母SPSC01的海藻糖6-磷酸合成酶基因TPS1的启动子P,与模式菌株S288C的TPS1启动... 详细信息

乙醇对酵母细胞的生长和代谢都具有较强的抑制作用,对酿酒酵母乙醇耐性的分子机制研究可为选育具有较强乙醇耐受性的酵母菌种提供理论基础。本文扩增了絮凝酵母SPSC01的海藻糖6-磷酸合成酶基因TPS1的启动子P,与模式菌株S288C的TPS1启动子比较发现,由于21个碱基的插入,P多了一个胁迫响应元件(StressResponsive Element,STRE),是一个新的启动子。利用pYES2.0载体骨架,构建了P启动绿色荧光蛋白EGFP标记基因的报告载体,并转化酿酒酵母ATCC4126。对转化子不同乙醇浓度,不同葡萄糖浓度,不同温度下EGFP的表达情况进行荧光定量分析发现,P对乙醇浓度有特异响应,而对高温、高浓度葡萄糖不敏感,证明了P可用于乙醇胁迫程度的特异响应研究。锌离子对P活性的研究表明,锌离子的添加没有增强EGFP在酵母转化子中的表达量,说明锌离子在该条件下不能直接影响P的活性,添加锌离子的转化子胞内海藻糖含量和发酵终点的乙醇浓度没有显著提高,说明锌离子对酵母细胞乙醇发酵和乙醇耐性的影响可能和酵母的遗传背景有关。对酵母群体响应信号途径的转录激活子ARO80的编码基因研究表明,ARO80启动子不能启动绿色荧光蛋白的表达,对该基因在乙醇胁迫中的作用还需要进一步研究。本论文的研究结果为进一步构建絮凝酵母SPSC01基因组启动子的报告载体文库,研究不同基因启动子在絮凝酵母乙醇耐性分子机制中的作用奠定了基础。

关键词：絮凝酵母海藻糖合成酶绿色荧光蛋白报告载体乙醇耐性

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CXCR_4启动子报告载体的构建

肿瘤基础与临床 2015年第4期28卷 281-283页

作者：王艳李丹黄可殷小成惠州市第一妇幼保健院儿科广东惠州516001 南华大学附属第一医院儿科湖南衡阳421001

目的构建并鉴定含人CXCR4基因启动子的荧光素酶的报告载体。方法采用克隆人CXCR4基因启动子的序列,构建报告载体Pg L4.17-CXCR4,以其转染Jurkat细胞,然后测定荧光素酶的活性。结果扩增得到的CXCR4启动子序列与克隆人Pg L4.17-CXCR4的CX... 详细信息

目的构建并鉴定含人CXCR4基因启动子的荧光素酶的报告载体。方法采用克隆人CXCR4基因启动子的序列,构建报告载体Pg L4.17-CXCR4,以其转染Jurkat细胞,然后测定荧光素酶的活性。结果扩增得到的CXCR4启动子序列与克隆人Pg L4.17-CXCR4的CXCR4启动子序列和Gen Bank报道的一致。实验组荧光素酶的表达活性是874 809.020 0±39 510.624 6,与空白组的465.900 0±26.250 1和对照组的37 981.980 0±2 384.341 2总体比较差异有统计学意义(F=4 678.919,P报告载体被成功构建。

关键词： CXCR4启动子荧光素酶报告载体 Jurkat细胞

应用Gibson Assembly法快速构建人组蛋白甲基化转移酶启动子荧光素酶报告载体

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临床与病理杂志 2016年第12期36卷 1971-1974页

作者：朱进单玉喜阳东荣苏州大学附属第二医院泌尿外科江苏苏州215004

目的:快速构建人组蛋白甲基转移酶(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)启动子荧光素酶报告载体并验证其活性。方法:因EZH2启动子富含GC,故应用Gibson Assembly方法设计分两段扩增,然后将片段一步法连入pGL3-Basic质粒,构建荧光素酶报告... 详细信息

目的:快速构建人组蛋白甲基转移酶(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)启动子荧光素酶报告载体并验证其活性。方法:因EZH2启动子富含GC,故应用Gibson Assembly方法设计分两段扩增,然后将片段一步法连入pGL3-Basic质粒,构建荧光素酶报告载体,进行酶切鉴定。与p RL-TK内参照质粒共转染C4-2细胞,双荧光素酶分析法检测启动子的活性。结果:经酶切鉴定证实成功构建了EZH2启动子报告载体,双荧光索酶报告基因检测结果显示构建的报告载体具有启动子活性。结论:快速成功构建了具有启动子活性的EZH2启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌中EZH2表达调控机制提供必要的实验材料。

关键词： GibsonAssembly 报告载体人组蛋白甲基转移酶启动子活性