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体外人肝星状细胞活化的报告系统的建立

体外人肝星状细胞活化的报告系统的建立

作者：王磊北京大学医学部

学位级别：硕士

肝纤维化进展为肝硬化的风险高,其发生发展的关键因素是肝星状细胞活化。肝星状细胞活化后会高表达Ⅰ型胶原蛋白α1肽链(collagenⅠα1 peptide chain,COL1A1)和α-肌动蛋白-2(alpha-actin-2,ACTA2)等活化相关基因。本研究(1)旨在建立... 详细信息

肝纤维化进展为肝硬化的风险高,其发生发展的关键因素是肝星状细胞活化。肝星状细胞活化后会高表达Ⅰ型胶原蛋白α1肽链(collagenⅠα1 peptide chain,COL1A1)和α-肌动蛋白-2(alpha-actin-2,ACTA2)等活化相关基因。本研究(1)旨在建立一个评价人肝星状细胞中COL1A1或ACTA2基因启动子活性的可视化报告系统,以此判断细胞活化状态,为抗肝纤维化药物的研究提供新的细胞模型。构建以不同长度COL1A1或ACTA2启动子序列调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达的数种重组质粒。先通过293T细胞瞬时转染实验确证EGFP表达,再用p LVX-1094-COL1A1-EGFP和p LVX-1601-ACTA2-EGFP质粒分别构建了稳转单克隆细胞株LX-2-CE和LX-2-AE。用荧光显微镜和Image J 1.49软件对细胞中EGFP的总荧光强度(total fluorescence intensity,TFI)和平均荧光强度(average fluorescence intensity,AFI)做半定量分析。本研究将4种中药活性成分或化合物和3种中成药用于实验。在10 ng/ml转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)激活条件下,与TGF-β1单处理组相比,经过10μmol/L二氢丹参酮Ⅰ处理后,LX-2-CE或LX-2-AE的TFI和AFI均有下降趋势,但LX-2-CE中此两指标的变化更明显(P报告系统,可在体外直观报告活化相关标志物COL1A1表达,发现扶正化瘀方和安络化纤丸可能通过抑制活化的肝星状细胞COL1A1的表达发挥抗肝纤维化作用,为抗肝纤维化药物的筛选和研究提供了新的细胞模型。

关键词：肝纤维化肝星状细胞 Ⅰ型胶原蛋白α1肽链启动子增强型绿色荧光蛋白报告系统

乳酸乳球菌NZ9000中增强型绿色荧光蛋白报告系统的构建

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食品与发酵工业 2020年第11期46卷 46-51页

作者：刘璐艾连中夏永军熊智强管彤宋馨上海理工大学医疗器械与食品学院上海食品微生物工程研究中心上海200093

增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,eGFP)基因是遗传操作系统中常用的报告基因,以eGFP为报告基因评价不同启动子在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中的调控能力,寻找能够高效表达外源蛋白的强启动子。以实验... 详细信息

增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,eGFP)基因是遗传操作系统中常用的报告基因,以eGFP为报告基因评价不同启动子在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中的调控能力,寻找能够高效表达外源蛋白的强启动子。以实验室构建的携带eGFP基因的pIB184-eGFP质粒为载体,PCR扩增来源于pLpCas9-0537、pMG36e、pNZ44的启动子P 11、P 32、P 44,将其分别克隆至pIB184-eGFP上,构建基于eGFP的报告系统。酶标仪定量测定eGFP的表达强度,比较不同启动子的转录活性。结果表明,在乳酸乳球菌中启动子P 11转录的活力十分微弱,启动子P 23、P 32、P 44的转录活性分别比P 11高约23.9、7.8、4.1倍。该文利用基于eGFP的报告系统,筛选出适用于乳酸乳球菌中不同转录活性的启动子,为外源基因在乳酸乳球菌中的表达奠定了基础。

关键词：乳酸菌乳酸乳球菌增强型绿色荧光蛋白报告系统启动子

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精准编辑调控基因时空表达的新型报告系统

精准编辑调控基因时空表达的新型报告系统

基于单域抗体的新型报告系统在活细胞内甲型流感病毒感染检测中的应用

首届植物科学前沿学术大会

作者：沈润东姚琦田益夫朱健康陆钰明中国科学院分子植物科学卓越创新中心(上海植物逆境生物学研究中心)

通过精准编辑技术优化关键基因的时空表达已成为分子设计育种的一项重要方法。与传统转基因异位表达不同,原位编辑后的目的基因表达受到其上下游序列的影响。我们的研究表明,现有报告系统(例如荧光素酶)因缺乏内源基因组序列,其瞬时表... 详细信息

通过精准编辑技术优化关键基因的时空表达已成为分子设计育种的一项重要方法。与传统转基因异位表达不同,原位编辑后的目的基因表达受到其上下游序列的影响。我们的研究表明,现有报告系统(例如荧光素酶)因缺乏内源基因组序列,其瞬时表达结果与实际编辑后的表达调控情况往往存在较大差异。这里,我们通过将新型标签HiBiT(11-aa)与植物内源序列融合,开发出了一种新的可精准定量原位编辑表达水平的报告系统。为验证这一系统的准确性,我们将其与传统的双荧光素酶报告系统进行了比较,用于检测转录增强子和翻译增强子这两种不同的表达调控元件对水稻内源基因OsWRKY71和OsEUI的作用。同时,我们利用基因编辑技术将这两个元件分别敲入到水稻内源基因OsWRKY71和OsEUI的非编码区域,成功获得了定点整合突变体。通过检测目的基因的转录水平及翻译水平,我们发现这两种表达调控元件在植物体内中的作用均与在新型报告系统中的效果更为一致。这一结果证实了含有植物内源序列的新型报告系统对评估基因表达调控元件活性具有更好的能力,表明其在利用基因编辑进行基因时空表达优化时具有潜在的应用价值。

关键词：报告系统 HiBiT 荧光素酶表达调控基因编辑

来源： cnki会议评论

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基于单域抗体的新型报告系统在活细胞内甲型流感病毒感染检测中的...

作者：张保惠厦门大学

学位级别：硕士

流行性感冒病毒,简称流感病毒,可导致急性呼吸道感染及其他轻到重度疾病乃至死亡,其传播范围覆盖全人群,给全球公共卫生带来沉重负担。四种型别的流感病毒当中,甲型流感病毒(IAV)的宿主范围最为广泛,加之突变率高,使其成为人类季节性流... 详细信息

流行性感冒病毒,简称流感病毒,可导致急性呼吸道感染及其他轻到重度疾病乃至死亡,其传播范围覆盖全人群,给全球公共卫生带来沉重负担。四种型别的流感病毒当中,甲型流感病毒(IAV)的宿主范围最为广泛,加之突变率高,使其成为人类季节性流感和全球流感大流行的主要原因。IAV可以进一步划分为多种亚型,其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)突变所致的抗原漂移和抗原转移使新亚型IAV不断出现,导致现有疫苗和抗病毒药物防治效果不佳,因此急需开发有效的通用流感疫苗及广谱抗病毒药物。活细胞内IAV感染的检测对病毒的基础研究、疫苗和抗病毒药物的开发具有重要意义,然而现有手段主要为基于特定毒株改造的重组报告病毒系统,存在适用范围窄及复制效率受限等方面的缺陷。本文构建了一种新型的报告系统,利用单域抗体捕获,使IAV感染时宿主细胞中表达量最高且高度保守的核蛋白(NP)成为连接特异性转录激活因子DNA结合结构域(DBD)和激活结构域(AD)的骨架,重构其转录激活功能,进而使上游激活序列(UAS)下游的报告基因得以转录和表达,从而无需对IAV进行改造即可实现活细胞内病毒感染的可视化、定量化检测。经过特异性单域抗体配对的筛选及对系统的系列优化,本研究最终构建的一体化IAV-NP依赖的IAV感染报告系统实现了通过检测胞内荧光或培养上清荧光素酶活性报告活细胞内IAV-NP的表达,从而指示不同亚型IAV的感染。在IAV感染报告系统中验证了系统的可行性后,为进一步拓展系统的应用范围,以实现更为广泛的靶标蛋白检测,本研究还构建了一个通用的单域抗体噬菌体展示文库,用以快速淘选针对各类蛋白的特异性单域抗体,为新系统单域抗体配对的筛选提供基础。总而言之,本研究构建了一种基于单域抗体的新型报告系统。一方面,通过建立IAV-NP特异性报告系统,实现了活细胞内IAV感染的检测,为IAV基础研究及抗病毒药物的筛选提供了便捷、有效的新工具,为IAV病毒感染模型的建立开拓了新的思路。另一方面,通过构建单域抗体文库,为报告系统的拓展应用奠定了基础。

关键词：甲型流感病毒核蛋白报告系统单域抗体

基于BERT预训练模型的教育装备供应链舆情报告系统

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科技与创新 2022年第16期 48-51页

作者：章艳华杨硕柳超江苏电子信息职业学院商学院江苏淮安223003

研究一种基于BERT预训练模型的教育装备供应链舆情报告系统,系统通过信息抽取技术从互联网环境的多源响应信息源中抓取舆情信息,并使用BERT预训练模型进行舆情分析,对系统核心构成“数据分析”模块进行了较为详细的介绍。实践证明,本系... 详细信息

研究一种基于BERT预训练模型的教育装备供应链舆情报告系统,系统通过信息抽取技术从互联网环境的多源响应信息源中抓取舆情信息,并使用BERT预训练模型进行舆情分析,对系统核心构成“数据分析”模块进行了较为详细的介绍。实践证明,本系统可有效挖掘出数据背后的价值,帮助用户快速获取丰富且准确的信息。

关键词：教育装备舆情系统 BERT预训练模型报告系统

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实施任务驱动式的医疗安全事件报告系统初探

中华医院管理杂志 2018年第6期34卷 474-476页

作者：李桐杨祝伟邓雯魏威任宇飞李刚华中科技大学同济医学院附属同济医院武汉400030

建立良好的医疗安全事件报告体系是提高医疗安全管理水平的重要保障。我院在总结既往报告系统基础上，检索国内外相关文献研究，在新院区设计并构建基于医院信息化，涵盖医疗、药品、器械、输血、医院感染和后勤等方面的任务驱动式医疗... 详细信息

建立良好的医疗安全事件报告体系是提高医疗安全管理水平的重要保障。我院在总结既往报告系统基础上，检索国内外相关文献研究，在新院区设计并构建基于医院信息化，涵盖医疗、药品、器械、输血、医院感染和后勤等方面的任务驱动式医疗安全事件报告系统。新系统减少审批环节、应用任务驱动模式，提高了医务人员报告积极性和安全事件处置效率，提升了医疗安全管理水平。

关键词：安全管理任务驱动医疗安全事件报告系统

一种快捷可靠评价链霉菌噬菌体准ФC31整合酶功能的双荧光报告系统(英文)

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生物化学与生物物理进展 2009年第7期36卷 929-933页

作者：徐焕宇马晴雯任兆瑞巩芷娟黄淑帧曾凡一曾溢滔上海交通大学附属上海市儿童医院上海医学遗传研究所上海200040 上海交通大学医学科学院上海200025 卫生部胚胎与分子生物学重点实验室上海200040

在NIH3T3细胞中构建了一种链霉菌噬菌体准ФC31整合酶报告系统.该报告载体同时编码红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白,与编码准ФC31整合酶的载体共转染可以反映准ФC31整合酶的活性.细胞中从红色荧光到绿色荧光的变化和百分比的变化可经流式... 详细信息

在NIH3T3细胞中构建了一种链霉菌噬菌体准ФC31整合酶报告系统.该报告载体同时编码红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白,与编码准ФC31整合酶的载体共转染可以反映准ФC31整合酶的活性.细胞中从红色荧光到绿色荧光的变化和百分比的变化可经流式细胞仪检出.随着转染中准ФC31整合酶表达载体的比例升高,表达绿色荧光的细胞比例上升.准ФC31整合酶表达载体和报告系统载体比例在10∶1时,可达最高约90%的红绿荧光转变率.这表明该准ФC31整合酶报告系统提供了一种在细胞中快捷可靠的评价准ФC31整合酶功能的方法.

关键词： ФC31整合酶报告系统位点特异性重组 NIH3T3细胞系

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人类卵母细胞报告系统的构建

生物技术通报 2015年第11期31卷 251-256页

作者：罗梦圆纪家葵清华大学医学院干细胞与再生医学中心北京100084

体外分化培养干细胞得到成熟生殖细胞具有重要的科学价值和临床意义,构建出人类胚胎干细胞体外分化为卵细胞的报告系统,旨在能为这一研究提供有效的工具。ZP2是组成哺乳动物卵细胞周围透明带的重要蛋白之一,其蛋白只能在卵细胞中表达,... 详细信息

体外分化培养干细胞得到成熟生殖细胞具有重要的科学价值和临床意义,构建出人类胚胎干细胞体外分化为卵细胞的报告系统,旨在能为这一研究提供有效的工具。ZP2是组成哺乳动物卵细胞周围透明带的重要蛋白之一,其蛋白只能在卵细胞中表达,具有很高的组织特异性。将人ZP2基因300 bp和2 500 bp启动子片段分别与e GFP荧光蛋白基因连接,利用Gateway系统构建出重组质粒ZP2-300-e GFP和ZP2-2500-e GFP,在WI38、未分化的人胚胎干细胞H9和小鼠卵母细胞中验证其荧光蛋白表达组织特异性。结果表明,ZP2-2 500-e GFP报告系统可以特异启动荧光报告基因在小鼠的卵母细胞中的表达。

关键词：报告系统 ZP2 卵母细胞

小鼠胚胎干细胞分化过程中通过Pax6-GFP报告基因系统高效获得神经祖细胞的研究

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小鼠胚胎干细胞分化过程中通过Pax6-GFP报告基因系统高效获得神经...

作者：李艳妮南开大学

学位级别：硕士

神经类退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症能毁灭性地影响患者的运动能力或记忆功能,给亲属及其社会造成了巨大的负担,且目前尚未有可行的治愈方案,主要原因在于缺乏合适的细胞或动物模型进行药物治疗研究。小鼠胚... 详细信息

神经类退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症能毁灭性地影响患者的运动能力或记忆功能,给亲属及其社会造成了巨大的负担,且目前尚未有可行的治愈方案,主要原因在于缺乏合适的细胞或动物模型进行药物治疗研究。小鼠胚胎干细胞（mESCs）因其具有能分化成三个胚层细胞的多能性且不存在伦理问题而被广泛运用在各个研究领域。然而,体外mESCs的谱系特化是不同步且难以控制的,就神经谱系的特化而言,目前尚没有一个严格的标准用于指示mESCs的神经分化。神经祖细胞（NPCs）是指可以分化到多种神经元的神经前体细胞,是mESCs分化到神经元的中间态细胞,它既可以通过分离早期胚胎的大脑组织获得,也可以利用ESCs进行体外分化获得,其在临床细胞替代性治疗方面有很大的应用前景。目前,在小鼠ESCs分化到NPCs的过程中,除实时观察细胞表型变化外,没有一个科学的系统行之有效地指示分化的进程,并且体外分化周期长,效率较低,导致最终获得的NPCs细胞数量不足以达到细胞替代治疗的需求,其根本原因还在于调控小鼠ESCs进行神经分化的分子机制尚不明确。因此,亟需一种高效和严谨的系统直观地对小鼠ESCs神经分化进程进行评估,进而推进神经分化、细胞替代治疗和药物筛选的研究。在本研究中,我们通过CRISPR/Cas9技术开发了一个内源性荧光标记的mESCs报告系统。在该系统中,Pax6基因后插入了一个GFP基因,使其共享同一启动子,故而能可视化地追踪神经分化过程。通过改进基于拟胚体介导分化的方法,在经过7天的分化后,我们可以通过流式分选技术高效地富集到NPCs。因此,我们建立了一种更简便、更快捷的方法富集到高纯度、多潜能的可进一步分化为功能性神经元的NPCs。该系统可作为一种理想的工具细胞运用于大规模神经分化相关基因和药物的筛选研究,为神经科学的研究铺平道路。

关键词：神经祖细胞胚胎干细胞神经分化报告系统流式分选