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报告基因法测定重组人白细胞介素-2产品生物学活性的研究

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中国新药杂志 2024年第7期33卷 654-661页

作者：段茂芹郭莹罗倩倩于传飞付志浩徐纲领王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体室北京102629 中国食品药品检定研究院重组药物室北京100050 广州市药品检验所广州510160

目的:建立测定重组人白介素-2(recombinant human interleukin-2,rhIL-2)制品生物学活性的报告基因法(reporter gene assay,RGA)。方法:根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》 2020年版指导原则,构建慢病毒转染表达荧光素酶(luciferase,L... 详细信息

目的:建立测定重组人白介素-2(recombinant human interleukin-2,rhIL-2)制品生物学活性的报告基因法(reporter gene assay,RGA)。方法:根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》 2020年版指导原则,构建慢病毒转染表达荧光素酶(luciferase,Luc)的C8166细胞,进行rhIL-2生物学活性测定方法学优化与验证,优化内容包括孵育时间、细胞数量、待测样品的初始浓度和稀释比例;验证内容包括特异性、线性和准确性、精密度和耐用性。结果:优化后的检测条件为:孵育时间为24 h;细胞接种密度为1×10~5细胞·孔^(-1);待测样品以10 000 IU·mL^(-1)为起始浓度1∶3稀释10个梯度。荧光信号值强度与待测样品浓度拟合四参数曲线,计算相对效价。选用不同作用类型的细胞因子进行特异性验证均符合应用要求。采用50%,75%,100%,125%和150%的5个浓度点验证线性和部分准确性,实测与理论效价线性回归分析相关系数R~2=0.993 1,各浓度点的回收率均在80%~120%之间。标准品和供试品按5个不同的比例进行混合,测定供试品的加标回收率均在84%~111%之间,均符合质量控制要求。精密度验证主要考察日内和日间精密度及不同人员的重复性,日内、日间的精密度和不同人员之间的重复性相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<10%。选取第5,26和78代次的细胞测定荧光信号值,信噪比(S/N)无统计学差异,表明不同代次细胞均可达到检测要求。结论:建立的rhIL-2生物学活性RGA方法适用性强,可应用于质量控制放行检测中。

关键词：重组人白介素-2 生物学活性报告基因优化与验证

虫荧光素酶报告基因用于二噁英类化学物质的检测

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分析化学 2001年第7期29卷 825-827页

作者：张志仁徐顺清周宜开任恕刘志伟华中科技大学同济医学院环境医学研究所!武汉430030

虫萤光素酶报告基因检测二英类化学物质与传统的EROD法比较 ,灵敏度及线性范围均优于EROD法 ,并且检测时间缩短 ,操作简便。适合大量样本的快速筛选及半定量检测

关键词：二噁英虫荧光素酶报告基因

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报告基因的选择及其研究趋向

生理科学进展 2002年第4期33卷 364-366页

作者：薛丽香童坦君张宗玉北京大学医学部生物化学与分子生物学系北京100083

报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。由于具有灵敏度高、检测方便等特点,报告基因技术在转基因、启动子分析以及药物筛选等领域有了广泛的应用。近年来,随着荧光分析方法和技... 详细信息

报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。由于具有灵敏度高、检测方便等特点,报告基因技术在转基因、启动子分析以及药物筛选等领域有了广泛的应用。近年来,随着荧光分析方法和技术的进步,荧光素酶和绿色荧光蛋白成为众多报告基因中的后起之秀,本文以这两个报告基因为重点,综述了报告基因的特点、应用、近年来的进展以及未来发展方向。

关键词：报告基因选择绿色荧光蛋白荧光素酶发展方向

腺病毒载体介导的HSV1-tk报告基因感染心肌细胞后摄取^(125)I-FIAU的实验研究

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核技术 2008年第11期31卷 854-858页

作者：尹小花兰晓莉王瑞华刘影张永学华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科湖北省分子影像重点实验室武汉430022

携带HSV1-tk的重组腺病毒(Ad5-tk)以感染复数(MOI)为20、40、80的病毒滴度感染体外培养的乳鼠原代心肌细胞;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测感染后心肌细胞活力;应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测基因转导后心肌细胞内HSV1-... 详细信息

携带HSV1-tk的重组腺病毒(Ad5-tk)以感染复数(MOI)为20、40、80的病毒滴度感染体外培养的乳鼠原代心肌细胞;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测感染后心肌细胞活力;应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测基因转导后心肌细胞内HSV1-tkmRNA的表达情况,并研究对报告探针125I-FIAU的摄取情况。结果显示:不同滴度Ad5-tk感染组心肌细胞存活率与时间均呈负相关,且病毒滴度越大,心肌细胞存活率越低;心肌细胞感染Ad5-tk后24h,RT-PCR即可检测到HSV1-tkmRNA的表达,且MOI=40感染组的表达量高于MOI=20感染组(P报告基因HSV1-tk进入心肌细胞后,能表达生成有活性的磷酸化酶HSV1-TK,使心肌细胞对核素标记报告探针125I-FIAU有明确的摄取,摄取程度与时间呈正相关,且感染滴度为40时摄取率最高,这为活体报告基因心脏显像提供了细胞水平依据。

关键词：报告基因报告探针腺病毒细胞摄取心肌细胞

报告基因方法监测重金属汞及其化合物的早期毒性

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中国中药杂志 2006年第16期31卷 1346-1349页

作者：余占江杨秦杨晓达王夔北京大学药学院北京100083

目的:基于热休克信号响应和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因,建立HSE-SEAP-HeLa细胞模型,预测重金属(汞及其化合物)的早期毒性。方法:将pHSE-SEAP质粒转染到人子宫颈癌HeLa细胞中,建立瞬时HSE-SEAP响应模型。热休克(42℃,1 h)或重金属... 详细信息

目的:基于热休克信号响应和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因,建立HSE-SEAP-HeLa细胞模型,预测重金属(汞及其化合物)的早期毒性。方法:将pHSE-SEAP质粒转染到人子宫颈癌HeLa细胞中,建立瞬时HSE-SEAP响应模型。热休克(42℃,1 h)或重金属化合物(CdCl2,5μmol.L-1,4 h)处理后,在完全DMEM培养基中恢复48 h后,检测细胞上清液中的分泌型碱性磷酸酶的含量(表示该状态下细胞中的热休克蛋白表达量),同时用MTT方法检测对应浓度下的细胞活性,以验证模型的有效性和重复性。并用亚致死浓度(由MTT实验确定)的无机和矿物汞(HgCl2,HgS和朱砂)和柳硫汞钠处理细胞,检测诱导的细胞热休克响应。结果:热休克和CdCl2作用HSE-SEAP-HeLa细胞模型后,细胞上清液中的分泌型碱性磷酸酶的含量显著升高;热休克蛋白表达早于Cd2+对细胞活性的降低。4种汞化合物在亚致死浓度均诱导细胞内热休克蛋白的变化,但4种化合物的作用时间和浓度效应不同,显示不同类型的汞化合物早期毒性存在差异。结论:HSE-SEAP-HeLa细胞模型可有效检测重金属诱导的热休克应激作用,并具有良好的重复性,可应用于重金属有关的早期毒性预测或药物毒性评估。

关键词：热休克蛋白 HeLa细胞重金属报告基因

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报告基因法比较两种放线菌启动子的活性

微生物学报 2009年第11期49卷 1454-1458页

作者：李佳向四海杨秀山杨克迁首都师范大学生命科学学院北京100048 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101

【目的】比较启动子Psf与红霉素抗性基因启动子(PermE*)在链霉菌中的表达强度差异。【方法】本文利用卡那霉素抗性梯度以及邻苯二酚2,3-双加氧酶显色系统,比较了两个启动子的表达差异。【结果】两个启动子在棒状链霉菌(Streptomyces cla... 详细信息

【目的】比较启动子Psf与红霉素抗性基因启动子(PermE*)在链霉菌中的表达强度差异。【方法】本文利用卡那霉素抗性梯度以及邻苯二酚2,3-双加氧酶显色系统,比较了两个启动子的表达差异。【结果】两个启动子在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)NRRL3585、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)M145,委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230及变铅青链霉菌(Streptomyces lividansTK54)均高表达。在棒状链霉菌和天蓝色链霉菌中Psf的表达活性要强于PermE*。【结论】Psf和PermE*是适用于链霉菌的高活性启动子。这些数据为两个启动子的使用提供了参考依据,也为链霉菌基因表达元件提供了新的选择。

关键词：强启动子链霉菌报告基因

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Kl LAC4用作白色念珠菌的报告基因

Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2000年第5期32卷 516-520+549页

作者：陈曦陈江野中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室!上海200031

由于lacZ基因在白色念珠菌中不能工作。将克氏酵母的 β 半乳糖苷酶基因KlLAC4构建了能在白色念珠菌中工作的报告基因。KlLAC4基因融合到白色念珠菌乙醇脱氢酶基因 (ADH1)的启动子后面 ,在ADH1终止子的共同控制下构建KlLAC4的表达质粒 p... 详细信息

由于lacZ基因在白色念珠菌中不能工作。将克氏酵母的 β 半乳糖苷酶基因KlLAC4构建了能在白色念珠菌中工作的报告基因。KlLAC4基因融合到白色念珠菌乙醇脱氢酶基因 (ADH1)的启动子后面 ,在ADH1终止子的共同控制下构建KlLAC4的表达质粒 pYPB1 LAC4。pYPB1 LAC4转化白色念珠菌并测定了在固体培养基中的 β 半乳糖苷酶活性以及在液体培养基的 β 半乳糖苷酶活力。结果表明KlLAC4基因能作为报告基因应用于白色念珠菌基因表达调控的研究

关键词：白色念珠菌报告基因 KlLAC4 β-半乳糖苷酶

报告基因系统HSV1-sr39tk/FIAU监测治疗基因表达的体外研究

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核技术 2010年第8期33卷 592-597页

作者：张国鹏兰晓莉陈铨曹卫何勇张永学华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科湖北省分子影像重点实验室武汉430022

构建HSV1-sr39tk为报告基因,以VEGF165为治疗基因的重组腺病毒载体Ad5-sr39tk-IRES-VEGF165(Ad5-SIV),将其以不同感染复数(MOI=0、10、25、50、75、100)感染大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫激光共聚焦技术检测HSV1-sr39tk与VEGF165的表达。用酶联免疫吸附试验(ELISA)监测感染病毒后细胞培养上清中VEGF165蛋白分泌量;细胞摄取131I-FIAU实验监测HSV1-sr39tk报告基因的表达情况,以腺病毒包装增强型绿色荧光蛋白(Ad5-EGFP)为对照。结果显示:免疫共聚焦显微镜可观察到HSV1-sr39tk蛋白与VEGF165蛋白在细胞内成功表达;VEGF165蛋白分泌情况与MOI间呈线性正相关(P基因VEGF与报告基因HSV1-sr39tk的表达呈正相关,说明可通过报告基因HSV1-sr39tk监测治疗基因VEGF165的表达,为动物水平报告基因显像提供理论支持。

关键词：血管内皮生长因子骨髓间充质细胞报告基因基因治疗突变型Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺激酶

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报告基因核医学显像及研究进展

中华核医学杂志 2003年第6期23卷 374-376页

作者：修雁陈绍亮复旦大学附属中山医院核医学科上海200032

分子生物学及影像技术的发展,促使人类基因治疗试验能更好地开展.基因治疗其中一个主要问题是使治疗基因能有所受控地、有效地转染到靶组织,避免在非靶组织中表达.因此,在基因治疗过程中有必要对治疗基因进行监测.

关键词：报告基因治疗基因核医学显像双功能基因显像二步转录放大系统基因表达断层显像