检索结果-南通市图书馆

作者：范啸宇上海交通大学

学位级别：硕士

随着2013年治疗乳腺癌的kadcyla被FDA批准上市,ADC药物得到了飞速发展。到目前为止,已经有四种ADC药物获准上市,市场非常广阔。但是ADC药物在血浆中必须保持足够的稳定性,进入肿瘤细胞后又必须快速准确地释放出来,因此对ADC药物的质量... 详细信息

随着2013年治疗乳腺癌的kadcyla被FDA批准上市,ADC药物得到了飞速发展。到目前为止,已经有四种ADC药物获准上市,市场非常广阔。但是ADC药物在血浆中必须保持足够的稳定性,进入肿瘤细胞后又必须快速准确地释放出来,因此对ADC药物的质量提出了很高的要求。而ADC药物的偶联工艺更是保证ADC药物质量标准的最重要环节之一。本课题着重研究抗her2抗体偶联药物的偶联工艺开发,并探索了ADC药物的偶联工艺的影响因素。本文主要利用化学偶联方法将抗her2抗体的赖氨酸残基与小分子细胞毒素DM1通过SMCC相连接,研究了影响最终关键质量属性药物抗体连接比例(DAR值)和SEC-HPLC单体纯度的关键因素,并通过实验设计(DOE)确定实验计划,模拟出相应的分析模型。通过对方差、误差统计和残差的分析验证了模型的可靠性,并通过等高线图和3D曲面图分析各个关键影响因素的权重,最终通过模型模拟出优选条件,并加以验证。首先,我们将抗体的赖氨酸残基与SMCC相接,通过分析发现反应时间、反应p H值和抗体与SMCC的比例是影响DAR值的三个影响因素。通过响应面法进行实验设计,根据结果得知SMCC与抗体的摩尔浓度比对结果影响最大,其次是反应时间,最后是反应p H值。初步选定反应p H 6.0,反应时间100分钟,SMCC与抗体的摩尔浓度比为8作为第一步的反应条件。接下来,将第一步的产物与小分子毒素DM1相连,通过分析发现反应p H值、反应时间和DM1与抗体的摩尔比对最终产品的抗体偶联比例和SEC-HPLC单体纯度都有影响。通过响应面法进行试验设计,根据结果得知,对于DAR值而言,反应p H值影响最大,其次是反应时间,而DM1与抗体的摩尔比在限定范围内对结果影响不是很大。而对于最终产品的SEC-HPLC单体纯度而言,反应p H值影响最大,反应时间和DM1与抗体的摩尔比对结果影响都不是很大。综合两方面的结果,选定反应p H 5.2,反应时间5小时(300分钟),DM1与抗体的摩尔浓度比为7.3作为第二步的反应条件。将得到的第一步和第二步的反应条件进行三次平行验证试验,最终的UV-DAR值为3.52,SEC-HPLC单体纯度为98.8%,符合设定的质量要求。

关键词：抗体偶联药物抗her2抗体试验设计反应时间反应pH值药物抗体连接比例尺寸排阻色谱法

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甲醇-山梨醇混合碳源诱导提高抗her2抗体在糖基工程毕赤酵母中的表达

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生物技术通讯 2013年第5期24卷 610-615页

作者：高爱荣刘波唱韶红巩新徐敏锐徐威吴军军事医学科学院生物工程研究所北京100071 沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳110016 安徽大学生命科学学院安徽合肥230601

目的:以抗her2抗体为模型,研究抗体在糖基工程酵母菌中的表达及工程菌发酵技术。方法:首先通过摇瓶试验分析诱导用甲醇浓度对抗体表达的影响,并用高表达her2的SK-BR-3细胞分析抗her2抗体的抗原结合活性。以此为基础,在5 L发酵罐中研究甲... 详细信息

目的:以抗her2抗体为模型,研究抗体在糖基工程酵母菌中的表达及工程菌发酵技术。方法:首先通过摇瓶试验分析诱导用甲醇浓度对抗体表达的影响,并用高表达her2的SK-BR-3细胞分析抗her2抗体的抗原结合活性。以此为基础,在5 L发酵罐中研究甲醇-山梨醇混合碳源流加诱导对抗her2抗体表达水平的影响;收集发酵培养液,采用阳离子交换层析对目标产物进行纯化;利用SDS-PAGE、Western印迹、Lowry法对抗体的相对分子质量、浓度等进行分析。结果:摇瓶试验结果表明,甲醇浓度为0.5%时抗体表达量最高,且糖基工程毕赤酵母菌表达的抗her2抗体具有与SK-BR-3细胞抗原结合的活性;在5 L发酵罐中,利用甲醇和山梨醇混合诱导方式发酵表达抗体,其表达量可提高至0.6 g/L,比摇瓶诱导表达的抗体产量提高了近10倍;非还原SDS-PAGE及Western印迹表明抗体相对分子质量为1.5×105,与商业化抗体herceptin的大小一致;经过一步阳离子交换层析纯化,纯化后抗体浓度为0.365 g/L。结论:采用甲醇-山梨醇混合碳源诱导方式在5 L发酵罐中进行发酵表达,能够提高抗her2抗体在糖基工程酵母菌中的表达量,本研究可为抗体在酵母中的规模发酵技术提供重要参考。

关键词：抗her2抗体毕赤酵母诱导发酵

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人重链铁蛋白偶联her2抗体的纯化及其在成像中的初步应用

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生物技术通讯 2019年第2期30卷 235-241页

作者：殷惠陈龙张文远朱新杰许诺王婷婷盛复庚安徽医科大学解放军307临床学院北京100071 解放军总医院第五医学中心南院区放射科北京100071 北京大学化学与分子工程学院北京100871

目的:利用临床常用抗体将人重链铁蛋白(HFn)纳米材料更好地靶向肿瘤,以期改善肿瘤的靶向成像或药物治疗,促进蛋白类纳米材料向临床转化。方法:在大肠杆菌内表达纯化得到HFn,以抗人表皮生长因子受体2抗体(anti-her2)作为模型抗体,用双功... 详细信息

目的:利用临床常用抗体将人重链铁蛋白(HFn)纳米材料更好地靶向肿瘤,以期改善肿瘤的靶向成像或药物治疗,促进蛋白类纳米材料向临床转化。方法:在大肠杆菌内表达纯化得到HFn,以抗人表皮生长因子受体2抗体(anti-her2)作为模型抗体,用双功能交联剂马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(Mal-PEG-NHS)将HFn与anti-her2偶联形成HFn/anti-her2复合物;标记荧光后,观察其不同时间内在her2阳性乳腺癌荷瘤小鼠内的分布,判断其作为靶向肿瘤药物的可能性。结果:通过尺寸排阻凝胶色谱纯化的靶向复合物HFn/anti-her2保留典型的对称球状结构,粒径大小为16.88±0.49 nm,较HFn粒径7.11±0.1 nm增加;HFn/anti-her2组在肿瘤部位的荧光强度是对照组HFn的3倍,说明可以通过偶联抗体提升HFn的靶向性。结论:构建了人重链铁蛋白与抗体的复合物,提升了铁蛋白的靶向性。抗体铁蛋白复合物为铁蛋白类靶向成像及治疗药物的开发提供了新的思路。

关键词：人重链铁蛋白抗her2抗体乳腺癌肿瘤靶向

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胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的制备和抗肿瘤作用研究

胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的制备和抗肿瘤作用研究

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作者：汤沁浙江大学

学位级别：硕士

研究目的：在本实验室已有抗胃癌单链抗体库的基础上,研究单链抗体的表达方法;通过基因融合技术,将单链抗体与天花粉蛋白连接构成免疫毒素scFv-TCS,通过基因表达获得重组免疫毒素,在培养细胞和小鼠移植肿瘤模型中,研究其抗肿瘤作用。研... 详细信息

研究目的：在本实验室已有抗胃癌单链抗体库的基础上,研究单链抗体的表达方法;通过基因融合技术,将单链抗体与天花粉蛋白连接构成免疫毒素scFv-TCS,通过基因表达获得重组免疫毒素,在培养细胞和小鼠移植肿瘤模型中,研究其抗肿瘤作用。研究方法：第一部分：单链抗体在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达将cFv插入原核表达载体PET30a质粒,转入E. coli BL21(DE3),37℃,1mM IPTG诱导表达3h,离心收集菌体,超声破碎显示scFv以包涵体形式表达,在8M尿素变性环境下经Ni-NTA树脂纯化后逐级降低尿素浓度,最终透析至PBS中,得到可溶性scFv。将scFv插入真核表达载体pPIC9质粒,转入毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达120 h,得到scFv蛋白。第二部分：免疫毒素scFv-TCS在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达将scFv基因与天花粉蛋白(TCS)基因通过接头GGGGS融合,插入原核表达载体PET30a质粒,转入E. coli BL21(DE3),30℃,1 mM IPTG诱导表达3 h,离心收集菌体,超声破碎显示scIT以包涵体形式表达,在8M尿素变性环境下经Ni-NTA树脂纯化后逐级降低尿素浓度,最终透析至PBS中,得到可溶性scIT。将scIT插入真核表达载体pPIC9质粒,转入毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达120h,得到scIT蛋白。第三部分：体外和体内抗肿瘤作用研究体外实验,用MTT法测定scFv和scIT对人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞和人正常胃上皮GES-1细胞的毒性。体内试验,裸鼠皮下接种3×106人胃癌MGC-803细胞,成瘤率达100%,尾静脉注药scFv、scIT、TCS。第四部分：抗her2抗体对her2高表达胃癌的检测免疫新西兰兔获得抗her2胞外区多克隆抗体,与her2高表达人胃癌NCI-N87细胞检测结合力,对27位胃癌患者肿瘤切片进行免疫组化检测。研究结果：***蛋白在大肠杆菌中,37℃,1 mM PTG诱导3 h后超声破碎菌体,得到27kD的条带,显示以包涵体形式表达,经纯化透析复性后得到目的蛋白;在酵母系统中经过120 h甲醇诱导后以分泌蛋白形式表达,但表达量不高。***蛋白在大肠杆菌中,30℃,1 mM IPTG诱导3h后超声破碎菌体,得到60 kD的条带,显示以包涵体形式表达,经纯化透析复性后得到目的蛋白;在酵母系统中经过120h甲醇诱导后以分泌蛋白形式表达,但表达量不高。***、scIT在体外实验中,对MGC-803细胞具有毒性;体内实验显示scFv、scIT均具有抑制肿瘤生长作用。4.抗her2-ECD抗体可以特异性结合her2高表达胃癌NCI-N87细胞,与her2低表达胃癌MGC-803细胞不结合,对27例胃癌患者的检测结果得到4例IHC阴性,7例IHC 1+,11例IHC 2+,5例IHC 3+。结论：成功表达并纯化scFv和免疫毒素scFv-TCS蛋白,在裸鼠移植性人胃癌模型中显示对胃癌生长的抑制作用;获得具有高特异性的抗her2抗体,可用于检测胃癌患者her2表达水平。

关键词：单链抗体免疫毒素抗her2抗体胃癌

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基于修饰后蛋白纳米材料靶向肿瘤的成像及治疗研究

基于修饰后蛋白纳米材料靶向肿瘤的成像及治疗研究

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作者：殷惠安徽医科大学

学位级别：硕士

【目的】随着生物医学技术发展,越来越多的纳米材料用于癌症的靶向成像及治疗,其中,纳米材料作为靶向药物载体一直是研究的热点。铁蛋白由于具有生物相容性高、易于修饰及可装载药物的空心纳米笼状结构等优点,因此具备良好的肿瘤靶向药... 详细信息

【目的】随着生物医学技术发展,越来越多的纳米材料用于癌症的靶向成像及治疗,其中,纳米材料作为靶向药物载体一直是研究的热点。铁蛋白由于具有生物相容性高、易于修饰及可装载药物的空心纳米笼状结构等优点,因此具备良好的肿瘤靶向药物载体潜质。同时,肿瘤特异抗体已经在肿瘤靶向治疗方面展现了巨大的功效,因此将铁蛋白与肿瘤特异抗体结合将更好的发挥两者的优势。本研究通过结合铁蛋白药物载体和抗体高靶向性的优势,将人重链铁蛋白(HFn)与抗人表皮生长因子受体-2抗体(anti-her2)偶联构成一种纳米探针,探究了此纳米探针对人表皮生长因子受体-2(her2)阳性乳腺癌靶向成像,初步表征了其在体内的代谢时间,为后期的载药靶向治疗提供了基础依据。【方法】通过在大肠杆菌中表达并纯化得到HFn;以her2抗体(anti-her2)作为模型抗体,通过双功能交联剂MAL-PEG-NHS将HFn与anti-her2偶联形成复合物(HFn/anti-her2),并通过尺寸排阻凝胶色谱进行分离纯化;利用动态光散射(DLS)及透射电镜(TEM)对复合物进行尺寸及稳定性表征;构建了her2阳性乳腺癌肿瘤裸鼠并利用生物发光成像验证构建成功;将HFn与HFn/anti-her2标记Cy5.5荧光染料后,利用共聚焦显微镜,观察复合物在不同her2表达的乳腺癌细胞内的分布;尾静脉注射入荷瘤乳腺癌裸鼠体内,分别在不同时间点进行荧光成像,检测偶联后探针在荷瘤裸鼠体内的肿瘤靶向能力,判断其开发为检测试剂的潜力;在注射24h后解剖荷瘤裸鼠,观察在24h时的不同器官的荧光分布。【结果】通过大肠杆菌表达获得HFn,以凝胶电泳鉴定纯度高。HFn与anti-her2偶联形成复合物后通过尺寸排阻色谱纯化,DLS显示HFn/anri-her2粒径(16.88±0.49nm)较HFn粒径(7.11±0.1nm)增加;在PBS中保存一个月,粒径分布均匀且大小未发生变化,具有良好的稳定性;细胞水平荧光成像,HFn/anti-her2复合物能更好的靶向her2阳性的乳腺癌细胞;活体动物水平荧光成像,在肿瘤部位展示了比HFn更好的肿瘤靶向性,说明可以通过偶联抗体提升重链铁蛋白的靶向性。【结论】本研究构建了HFn/anti-her2,重链铁蛋白可作为载药或成像的平台,抗体有很好的靶向作用,为探索构建应用于her2阳性的乳腺癌的蛋白类靶向成像及载药平台提供依据,具有潜在的开发为靶向诊疗试剂的潜力。

关键词：重链铁蛋白抗her2抗体乳腺癌靶向

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