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脓毒症早期cd28对Th17与Treg细胞平衡的影响及其潜在机制

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脓毒症早期CD28对Th17与Treg细胞平衡的影响及其潜在机制

作者：吴昱中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

脓毒症(sepsis)是指病原体逃避宿主的防御机制，持续刺激和损伤宿主细胞，导致宿主免疫功能紊乱并最终出现器官功能障碍[1,2]，是住院患者最主要的死亡原因之一[3]。2017年全球因脓毒症死亡的患者约为1100万，占所有死亡人数的近20％[4... 详细信息

脓毒症(sepsis)是指病原体逃避宿主的防御机制，持续刺激和损伤宿主细胞，导致宿主免疫功能紊乱并最终出现器官功能障碍[1,2]，是住院患者最主要的死亡原因之一[3]。2017年全球因脓毒症死亡的患者约为1100万，占所有死亡人数的近20％[4,5]。尽管通过控制感染源、及时有效应用抗生素、充分液体复苏和重要脏器支持等治疗策略[5]，脓毒症早期死亡率有所下降，但仍有很多患者因继发性感染死亡。尽早识别脓毒症并及时采取个性化的干预措施可改善患者的预后，但早期识别脓毒症仍有一定困难[6]。为有效治疗脓毒症，降低脓毒症的高发病率和死亡率，迫切需要找到有效的治疗方法和靶点。　　免疫治疗(immunotherapy)是根据机体免疫状态，通过药物增强或抑制机体免疫系统达到治疗目的的方法[7]。针对部分肿瘤的免疫治疗已经取得重大进展，但对脓毒症的免疫治疗仍在探索中。T淋巴细胞（下面简称“T细胞”）是机体重要的免疫细胞，许多临床研究提示T细胞明显减少时患者易感染加重，预后更差[8]。T细胞通过共刺激分子cd28与APC表面的B7家族分子cd80/cd86结合后激活发挥作用[9]。cd28能够调节T细胞亚型之间的平衡[10]，在一些疾病的发生发展中起重要作用，尤其是辅助Th17细胞(Th17)和调节性T细胞(Treg)，Th17细胞和Treg细胞之间的平衡是脓毒症免疫调节机制的一个关键节点，平衡一旦被打破，将加重脓毒症的预后[11]。本研究拟通过阻断cd28调节脓毒症时Th17/Treg细胞失衡，实现改善脓毒症预后的目的。　　研究目的　　观察早期脓毒症患者cd28、Th17细胞、Treg细胞及Th17/Treg细胞比值评估对ICU住院时间的预测价值，并进一步通过阻断脓毒症小鼠cd28来明确调节Th17/Treg细胞比值对脓毒症预后的影响。　　研究方法　　1.探究脓毒症患者Th17/Treg细胞水平对临床预后的影响。　　评估脓毒症患者与健康志愿者Th17/Treg细胞比值与cd28的表达差异;纳入我院重症监护病房2020年1月至2020年10月收治的65例脓毒症患者，记录患者的一般资料、SOFA评分、APACHEⅡ评分、ICU住院时间以及预后等情况。检测外周静脉血IL-6、TNF-α、IL-10以及IL-17A的表达水平，同时分离患者外周血PBMC，采用流式细胞仪分析患者cd28、cd80、cd86、CTLA-4等膜抗体的表达水平以及FoxP3、IFN-γ、IL-4、IL-17A等胞内抗体的表达水平。分析Th17/Treg细胞比值对脓毒症患者住院时间的预测价值。　　2.脓毒症小鼠不同时期Th17细胞与Treg细胞水平变化。　　小鼠随机分为假手术组和盲肠结扎穿刺组(CLP)组，其中CLP组小鼠分别在术后24h、72h、5d、7d采样分析脾脏Th17细胞和Treg细胞水平，及相关细胞因子水平。观察抗小鼠cd28抗体对脓毒症小鼠生存率、临床评分及脓毒症小鼠3天后脾脏指数、脾脏病理损伤及血清IL-6、TNF-α、IL-10、IL-17A表达水平的影响;3.抗小鼠cd28抗体对脓毒症小鼠Th17/Treg细胞比值的影响及其潜在机制。　　将小鼠随机分为假手术组（Sham组）、CLP组、CLP+抗cd28抗体组(CLP+anti-cd28)、CLP+同型抗体对照组(CLP+isotype)，所有CLP组在手术后即分别给予生理盐水、抗cd28抗体和同型IgG腹腔内注射。检测3天后脾脏Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg细胞比值水平以及脾脏细胞凋亡、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。　　实验结果　　1.早期脓毒症患者外周血Th17/Treg细胞比值、cd28的表达水平明显高于正常志愿者。ICU住院时间大于14d的脓毒症患者Th17细胞、IL-17A表达水平、Th17/Treg细胞比值明显高于ICU住院时间小于14d的患者。cd28、CTLA-4、cd80、cd86以及Th1细胞、Th2细胞、Th1/Th2细胞比值两组之间的表达水平没有差异。Th17/Treg细胞比值与脓毒症患者早期SOFA评分、APACHEⅡ评分、PCT表达水平与脓毒症患者的住院时间和呈正相关。Th17/Treg细胞比值与APACHEⅡ评分两个指标联合预测脓毒症患者ICU住院时间超过14天的曲线下面积(AreaUnderCurve,AUC)为0.800(95％CI:0.676-0.892)。　　2.脓毒症小鼠CLP术后1、3、5、7d的脾脏Th17细胞、Treg细胞表达明显高于假手术组小鼠。CLP术后5d，小鼠脾脏细胞Th17细胞和Treg细胞升高的最显著，而Th17/Treg细胞比值在术后3d处于高峰值。抗cd28抗体能改善脓毒症CLP小鼠生存率、临床评分、脾脏指数并减轻脾脏的组织损伤。CLP小鼠给予抗cd28抗体3d后，血清促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-17A的表达降低

关键词：脓毒症抗cd28抗体 ICU住院时间细胞凋亡

噬菌体展示cd28、cd137及生物活性测定

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药物分析杂志 2005年第9期25卷 1106-1110页

作者：李娜张利宁高尚先王群刘兴田朱法良郭春山东大学医学院免疫学研究所济南250012 中国药品生物制品检定所北京100050

目的:以噬菌体展示具有天然结构的人 cd28、cd137分子胞外区,检测其抗原性和生物活性,为 cd28、cd137拮抗性类肽药物的筛选奠定基础。方法:构建 cd28、cd137噬菌粒表达载体 pComb3H-cd28、pComb3H-cd137,以噬菌体展示系统展示 cd28、cd... 详细信息

目的:以噬菌体展示具有天然结构的人 cd28、cd137分子胞外区,检测其抗原性和生物活性,为 cd28、cd137拮抗性类肽药物的筛选奠定基础。方法:构建 cd28、cd137噬菌粒表达载体 pComb3H-cd28、pComb3H-cd137,以噬菌体展示系统展示 cd28、cd137分子胞外区。以 ELISA、流式细胞仪检测噬菌体展示 cd28的抗原性和与 cd80的结合力,ELISA 检测噬菌体展示 cd137的抗原性,MTT 法检测噬菌体展示 cd28、cd137的生物活性。结果:成功构建重组噬菌粒载体 pComb3H-cd28、pComK3H-cd137,并以噬菌体展示系统展示 cd28、cd137分子。ELISA 结果显示,噬菌体展示 cd28可与抗 cd28抗体特异性结合,也可与 cd80特异性结合;FCM 结果显示,噬菌体展示 cd28可与 Jurkat 细胞表面 cd28竞争结合抗 cd28抗体,也可与 Raji 细胞表面 cd80结合。ELISA 结果显示,噬菌体展示 cd137可与抗 cd137抗体特异性结合。体外生物活性实验显示,噬菌体展示 cd28、cd137可抑制抗 cd28抗体、抗 cd137抗体刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应。结论:利用噬菌体展示系统成功展示 cd28、cd137分子,噬菌体展示 cd28、cd137具有抗原性及生物活性,为以 cd28、cd137为靶点体外高通量筛选cd28、cd137拮抗性类肽奠定基础。

关键词： cd28 cd137 噬菌体展示抗cd28抗体生物活性测定 ELISA检测流式细胞仪检测淋巴细胞增殖反应体外生物活性特异性结合

NOD小鼠未成熟树突状细胞体外诱导淋巴细胞生成并扩增调节性T细胞的研究

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器官移植 2011年第3期2卷 129-134页

作者：李永海张淦李明陈栋向莹郭晖张伟杰华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部器官移植重点实验室武汉430030 郑州人民医院肾移植科

目的探索非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)诱导并扩增调节性T细胞(regulatory Tcells,Treg)的优化方案。方法分离、培养NOD小鼠骨髓来源的imDC和淋巴细胞,并进行混合淋巴细胞培... 详细信息

目的探索非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)诱导并扩增调节性T细胞(regulatory Tcells,Treg)的优化方案。方法分离、培养NOD小鼠骨髓来源的imDC和淋巴细胞,并进行混合淋巴细胞培养,分别加入白介素(IL)-2、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1、抗cd3抗体和抗cd28抗体刺激淋巴细胞增殖、分化。实验分为4组:对照组(淋巴细胞+IL-2)、实验1组(淋巴细胞+imDC+TGF-β1+IL-2)、实验2组(淋巴细胞+imDC+抗cd3抗体+抗cd28抗体+IL-2)、实验3组(淋巴细胞+imDC+抗cd3抗体+抗cd28抗体+TGF-β1+IL-2)。用流式细胞仪检测各组培养3d后淋巴细胞的扩增情况及混合培养6d淋巴细胞中cd4、cd25及Foxp3的表达。结果 imDC和淋巴细胞混合培养3d后,对照组、实验1组、实验2组和实验3组增殖指数分别为(1.04±0.03)%、(1.26±0.02)%、(1.36±0.01)%和(1.55±0.02)%。实验3组的增殖指数较实验1组和实验2组明显升高(均为Pcd4+cd25+T淋巴细胞亚群所占比例分别为(2.41±0.02)%、(17.98±1.02)%、(30.67±2.68)%、(42.84±1.41)%,而cd4+cd25+T淋巴细胞中Foxp3+细胞的比例4组分别为(65.55±1.41)%、(86±1.72)%、(70.29±1.39)%、(92.3±1.99)%,实验3组的淋巴细胞cd4+cd25+、Foxp3+的表达水平较实验1组和实验2组明显升高(均为P抗cd3抗体、抗cd28抗体可明显刺激imDC诱导扩增Treg,是体外诱导扩增Treg的理想方案之一。

关键词：未成熟树突状细胞非肥胖糖尿病小鼠转化生长因子-β1 抗cd3抗体抗cd28抗体调节性T细胞

COMPARISON　OF　ASSISTANT　EFFECTS　AMONG　ASSISTANT　MOLECULES　ON　T　CELL　ACTIVATION　BY　SUPERANTIGEN　TSST-1

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免疫学杂志 1997年第2期13卷 71-78页

作者：胡伟钢朱锡华吴玉章贾正才

对抗ＣＤ２８抗体、佛波酯（ＰＭＡ）和ＩＬ－２三种辅助分子在体外缺乏抗原提呈细胞（ＡＰＣ）的情况下辅助超抗原活化Ｔ细胞的作用进行比较。结果发现：抗ＣＤ２８抗体、ＰＭＡ和ＩＬ－２辅助超抗原活化Ｔ细胞的最适浓度分别为１０μ... 详细信息

对抗ＣＤ２８抗体、佛波酯（ＰＭＡ）和ＩＬ－２三种辅助分子在体外缺乏抗原提呈细胞（ＡＰＣ）的情况下辅助超抗原活化Ｔ细胞的作用进行比较。结果发现：抗ＣＤ２８抗体、ＰＭＡ和ＩＬ－２辅助超抗原活化Ｔ细胞的最适浓度分别为１０μｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ和１０００ｕ／ｍｌ；其中，抗ＣＤ２８抗体辅助超抗原活化Ｔ细胞的作用最强，ＰＭＡ次之，ＩＬ－２最弱。另外，对三种辅助分子辅助超抗原活化Ｔ细胞的机制进行了探讨。本研究为今后选择合适的辅助分子与合成肽技术共同组建一种有效的探找超抗原Ｔ细胞表位的方法奠定了基础。

关键词：超抗原辅助分子辅助作用抗原抗cd28抗体 PMA

人白细胞介素31基因克隆及在大肠杆菌中的表达

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遵义医学院学报 2006年第2期29卷 190-190页

作者：黄俊琼孙万邦杨吉成遵义医学院珠海校区广东珠海519041 苏州大学

人白细胞介素31(IL-31)是近年在'Nature Immunology'杂志上报道的新细胞因子,为一具有4个螺旋结构的单链分子,主要由激活的T细胞产生,基因定位于12q24.31,大小为904bp,开放阅读框495bp,编码一条由164个氨基酸残基组成的多肽链,成熟的IL... 详细信息

人白细胞介素31(IL-31)是近年在'Nature Immunology'杂志上报道的新细胞因子,为一具有4个螺旋结构的单链分子,主要由激活的T细胞产生,基因定位于12q24.31,大小为904bp,开放阅读框495bp,编码一条由164个氨基酸残基组成的多肽链,成熟的IL-31分子含有141个氨基酸.

关键词：人白细胞介素大肠杆菌基因克隆 T细胞表达低水平表达抗cd28抗体氨基酸残基抗cd3抗体开放阅读框 cd4^+