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抗菌肽merecidin通过ERK/mTOR信号通路对肺癌A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

现代预防医学 2022年第9期49卷 1671-1675+1683页

作者：张倩楠贾琴琴杨婷婷宋瑾萱王秀青宁夏医科大学临床医学院

目的探讨抗菌肽merecidin通过ERK/mTOR信号通路对肺癌A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法实验分为对照组Control、抗菌肽merecidin干预组和雷帕霉素Rapamycin干预组。通过CCK-8法检测A549细胞的增殖能力，通过流式细胞术检测... 详细信息

目的探讨抗菌肽merecidin通过ERK/mTOR信号通路对肺癌A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法实验分为对照组Control、抗菌肽merecidin干预组和雷帕霉素Rapamycin干预组。通过CCK-8法检测A549细胞的增殖能力，通过流式细胞术检测A549细胞凋亡和周期，通过平板划痕试验和Transwell检测A549细胞的迁移和侵袭能力，通过Western blot法检测A549细胞中MAPK1、MEK2、mTOR、PRAS40、EIF4EBP1磷酸化蛋白的表达量。结果抗菌肽merecidin能够明显抑制A549的增殖能力，处理24 h后的IC50值为10.01μmol/L(P抗菌肽merecidin处理后促进细胞凋亡(P抗菌肽merecidin可抑制p-MAPK1和p-MEK2蛋白的表达，并且降低了mTOR、PRAS40和EIF4EBP1的磷酸化水平(P抗菌肽merecidin可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期于S期，该作用可能与其抑制ERK/mTOR通路有关。

关键词：抗菌肽merecidin A549细胞增殖凋亡迁移侵袭 ERK/mTOR

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抗菌肽merecidin对三阴性乳腺癌细胞抑制作用的研究

抗菌肽Merecidin对三阴性乳腺癌细胞抑制作用的研究

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作者：宋瑾萱宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的研究抗菌肽merecidin对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响并初步探讨其作用机制。方法1.通过CCK-8、平板集落形成实验探讨不同浓度merecidin处理对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响;2.细胞划痕和Transwell实验探讨不同浓度Merecidi... 详细信息

目的研究抗菌肽merecidin对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响并初步探讨其作用机制。方法1.通过CCK-8、平板集落形成实验探讨不同浓度merecidin处理对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响;2.细胞划痕和Transwell实验探讨不同浓度merecidin处理对三阴性乳腺癌细胞迁移及侵袭的影响;3.激光共聚焦显微镜观察merecidin在三阴性乳腺癌细胞中的定位,乳酸脱氢酶（LDH）实验检测merecidin作用后LDH的活性;4.Pull down实验确定三阴性乳腺癌细胞与merecidin的互作蛋白vimentin,并通过GEO数据库或生物信息学软件分析与其靶向的miR-30d-5p,q-PCR验证其在三阴性乳腺癌中的表达水平;5.Western-blot验证上述互作蛋白vimentin及EMT关键蛋白snail,E-cadherin的表达水平;6.细胞划痕和Transwell实验探究miR-30d-5p和vimentin对三阴性乳腺癌细胞的迁移及侵袭的影响;7.q-PCR、Western-blot和双荧光素酶技术更进一步验证miR-30d-5p与vimentin之间的靶向关联;8.q-PCR检测不同浓度merecidin处理后三阴性乳腺癌细胞中miR-30d-5p的变化;细胞划痕和Transwell实验检测merecidin与miR-30d-5p或vimentin共同作用对三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响,Western-blot检测vimentin及EMT关键蛋白snail,E-cadherin的表达水平。结果1.merecidin能够有效抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468的生长,其24h半数抑制浓度(IC)达到6.94μM和9.74μM,分别以5μM和10μM的浓度处理两株细胞检测其集落形成能力,结果表明,随merecidin浓度增加,细胞形成集落的能力随之下降（Pmerecidin具有良好的抗癌活性;2.划痕和Transwell实验结果表明,与对照组相比,随着merecidin浓度增加,其对细胞迁移和侵袭的抑制作用也随之增加（Pmerecidin主要存在于细胞质中,LDH实验表明,与对照组相比,随着merecidin浓度增加,LDH的释放量也随之增加（Pmerecidin与三阴性乳腺癌细胞的互作蛋白中,确定vimentin为主要研究对象,通过生物信息学研究和GEO数据库,筛选出与vimentin靶向的miR-30d-5p,q-PCR检测发现,它在三阴性乳腺癌中表达水平较低（Pmerecidin浓度增加,vimentin及snail的表达下降,E-cadherin的表达增加（Pmerecidin治疗三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468后,miR-30d-5p的表达显著增加（Pmerecidin组）相比,单独加入merecidin组细胞的迁移和侵袭能力被抑制,与单独加入merecidin组相比,下调miR-30d-5p或过表达vimentin后再加入merecidin作用,细胞的迁移和侵袭能力均有一定程度的回复（Pmerecidin组）相比,单独加入merecidin组vimentin,snail的表达下降,E-cadherin的表达增加,与单独加入merecidin组相比,下调miR-30d-5p或过表达vimentin后再加入merecidin作用,vimentin,snail,E-cadherin的表达均有一定程度的回复（Pmerecidin能够有效地抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;主要分布于细胞质中;通过调控miR-30d-5p/vimentin轴,能够有效阻碍EMT过程,从而高效抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

关键词：抗菌肽merecidin 三阴性乳腺癌 miR-30d-5p vimentin 细胞迁移和侵袭

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抗菌肽merecidin诱导人肺腺癌细胞系A549凋亡

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基础医学与临床 2019年第4期39卷 473-477页

作者：战仕胜李军杨婷婷王雅蓉王秀青宁夏医科大学临床医学院检验系宁夏银川750000 唐山市工人医院检验科河北唐山063000

目的探讨抗菌肽merecidin对人肺癌细胞系A549的作用及其机制。方法实验分为对照组(Ctrl)、顺铂干预组(cisplatin 40μmol/L)、merecidin干预组(merecidin 25/35μmol/L)、caspase抑制剂组(z-VAD-fmk)、caspase抑制剂+merecidin干预组(z-VAD-fmk+merecidin 25/35μmol/L)。MTT法检测细胞增殖,annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,Western blot检测caspase-3、8、9、激活型caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果抗菌肽merecidin明显抑制A549细胞增殖(Pmerecidin处理24 h后的IC_(50)值为34.8μmol/L。与Ctrl组相比,merecidin干预组的凋亡率显著升高(Pmerecidin干预组相比,caspase抑制剂+merecidin干预组的凋亡率并没有下降。caspase-3、8、9蛋白表达无显著变化且未检测到激活型caspase-3蛋白表达。Bcl-2蛋白表达下调(P抗菌肽merecidin可以抑制人肺腺癌细胞A549的增殖并诱导其凋亡。

关键词：抗菌肽merecidin A549细胞凋亡

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抗菌肽merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜的机制研究

抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜的机制研究

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作者：王雅蓉宁夏医科大学

学位级别：硕士

背景课题组前期研究结果显示抗菌肽merecidin能够抑制临床分离菌株铜绿假单胞菌PA03形成的生物被膜,并对抗菌肽merecidin作用前后PA03形成的生物被膜进行了原核转录组测序分析。目的通过分析抗菌肽merecidin作用前后PA03形成的生物被膜... 详细信息

背景课题组前期研究结果显示抗菌肽merecidin能够抑制临床分离菌株铜绿假单胞菌PA03形成的生物被膜,并对抗菌肽merecidin作用前后PA03形成的生物被膜进行了原核转录组测序分析。目的通过分析抗菌肽merecidin作用前后PA03形成的生物被膜转录组测序结果,筛选差异表达基因,以期找到抗菌肽merecidin抑制铜绿假单胞菌PA03生物被膜的相关作用机制。方法1.根据抗菌肽merecidin处理前、后PA03形成的生物被膜原核转录组测序分析的结果,筛选目的基因。2.根据第一部分筛选到的结果,PCR扩增PA03菌株中的PA4781基因,插入p MP2444载体,构建PA4781过表达载体,电转化进入PA03感受态细胞,构建PA4781过表达菌株,菌落PCR验证其正确性。根据PA4781基因序列设计3个靶点sg RNA,使用pn Cas PA-BEC系统,以期在靶点处出现预期的碱基突变从而产生终止密码子,提前终止PA4781的转录,从而达到敲除PA4781基因的目的,Sanger测序方法检测敲除的正确性。3.结晶紫染色法定量观察24h时PA03菌株,PA4781过表达菌株,PA4781敲除菌株生物被膜生长情况以及在抗菌肽merecidin作用下各菌株生物被膜的生长情况。采用对羟基联苯溶液显色法检测在抗菌肽merecidin作用下各菌株生物被膜藻酸盐的变化情况。采用HPLC检测在抗菌肽merecidin作用下各菌株生物被膜c-di-GMP含量。通过扫描电镜（SEM）观察抗菌肽merecidin作用下各菌株生物被膜的显微变化情况。将受试菌置于swimming、swarming运动平板观察各菌株运动能力变化情况。盐酸氯仿萃取后检测光密度值检定受试菌绿脓菌素的表达情况。结果1.经分析筛选并用Real time PCR验证,PA4781基因在抗菌肽merecidin12、24、48μmol/L作用下其基因表达分别为对照组PA03的2.8、3.3、3.9倍。将PA4781基因作为本研究的靶基因进行后续的实验研究。PA4781作为细菌第二信使分子环二鸟苷酸（cyclic diguanylate,c-di-GMP）的磷酸二酯酶具有降解c-di-GMP的作用。2.PCR筛选及Sanger测序结果证明PA4781过表达,敲除菌株构建成功。3.（1）结晶紫染色结果显示,培养24h时,在24μmol/L抗菌肽merecidin作用下,PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株这3株菌生物被膜形成情况无显著性差异（P＞0.05）,在抗菌肽merecidin48、72μmol/L处理下,过表达株与正常株和敲除株有显著性差异（P＜0.05）,生物被膜明显减少,敲除株生物被膜厚度高于PA03组（P＜0.05）。（2）随着抗菌肽merecidin浓度增加各组藻酸盐含量下降,其中过表达菌株在抗菌肽merecidin作用下藻酸盐生成量抑制率最高,可达65%。（3）PA4781敲除株c-di-GMP含量高于PA03及PA4781过表达菌株（P＜0.05）。抗菌肽merecidin处理后PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜c-di-GMP含量均下降其中PA4781过表达菌株下降程度最大,当用抗菌肽merecidin 72μmol/L处理时,过表达菌株c-di-GMP的含量仅为不加药时生成量的37.2%,而敲除株pn Cas PABEC-ΔPA4781的c-di-GMP含量是未加药时的66.9%,PA03菌株的c-di-GMP含量是未加药时是58.8%。（4）扫描电镜观察各菌株生物被膜显微变化情况,发现抗菌肽merecidin处理后过表达菌株生物被膜形态破坏程度最为明显,且菌体受损最为严重。（5）通过对于各菌株运动能力的观察发现,抗菌肽merecidin能够抑制各菌株运动能力,其中过表达菌株效果最明显,抗菌肽merecidin 72μmol/L处理后过表达菌株已丧失运动能力。（6）抗菌肽merecidin作用下绿脓菌素被明显抑制。结论1.根据抗菌肽merecidin作用前后原核转录组测序分析,显示影响抗菌肽作用生物被膜的相关通路有很多,本实验中筛选出的靶基因PA4781提示抗菌肽merecidin抑制铜绿假单胞菌PA03生物被膜可能与细菌第二信使分子c-di-GMP有关。2.抗菌肽merecidin通过上调PA4781基因表达,增强其降解细菌第二信使分子c-diGMP的作用,从而放大c-di-GMP系统在抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的影响。而且抗菌肽merecidin还可能通过抑制细菌运动,及毒力因子绿脓菌素的产生,影响生物被膜的形成。

关键词：抗菌肽merecidin 铜绿假单胞菌生物被膜 c-di-GMP

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抗菌肽merecidin通过MAPK1调控肺腺癌A549细胞自噬的研究

抗菌肽merecidin通过MAPK1调控肺腺癌A549细胞自噬的研究

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作者：贾琴琴宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的抗菌肽merecidin作用于肺腺癌A549细胞后,通过检测细胞自噬相关蛋白表达差异以及观察merecidin对细胞亚结构的影响来探究merecidin诱导A549细胞自噬,并探讨详细的作用机制。方法1.利用CCK-8法检测0-16μmol·Lmerecidin对肺腺癌A54... 详细信息

目的抗菌肽merecidin作用于肺腺癌A549细胞后,通过检测细胞自噬相关蛋白表达差异以及观察merecidin对细胞亚结构的影响来探究merecidin诱导A549细胞自噬,并探讨详细的作用机制。方法1.利用CCK-8法检测0-16μmol·Lmerecidin对肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用,测定其IC50值;2.质谱检测抗菌肽9μmol·Lmerecidin处理肺腺癌A549细胞后蛋白质差异表达水平,并筛选出表达变化明显的自噬相关蛋白,富集调控自噬信号通路;3.透射电子显微镜检测0、9μmol·Lmerecidin对A549细胞,KO-MAPK1(敲除),NC-KO-MAPK1(敲除空载组),OE-MAPK1(过表达)及NC-OE-MAPK1(过表达空载组)细胞超微结构的影响;4.MDC染色检测0、9μmol·L merecidin对A549细胞,KO-MAPK1,NC-KO-MAPK1,OE-MAPK1及NC-OE-MAPK1细胞系的影响;5.AO染色检测0、9μmol·L merecidin对A549细胞,KO-MAPK1,NC-KO-MAPK1,OE-MAPK1及NC-OE-MAPK1细胞系的影响;6.CYTO-ID实验检测0、9μmol·L merecidin对A549细胞,KO-MAPK1,NC-KO-MAPK1,OE-MAPK1及NC-OE-MAPK1细胞系的影响;7.Western blot实验检测0、9、18μmol·L merecidin对A549细胞组、OE-MAPK1、KO-MAPK1组细胞ATG5、ATG7、ATG13、ULK1、LC3、MAPK1、P62、β-tublin蛋白表达的影响。结果1.抗菌肽merecidin抑制A549细胞增殖,24h半数抑制浓度IC50为9.05μmol·L2.蛋白组学分析:merecidin作用于A549细胞后,质谱肽段检测,Maxquant数据库检索分析整理结果显示表达上调的蛋白有:ATG2B,ULK1,RAB7A,ATG13,ATG9A等;表达下调的蛋白有:MAPK1,EIF4B,EGFR,TSC2,PAK4等;参与的主要的细胞信号通路有:PI3K-Akt,mTOR,AMPK和Wnt等;PI3K-Akt,mTOR等为经典的调节细胞自噬的信号通路。3.透射电镜观察自噬小体:merecidin处理细胞后,处理组A549和KO-MAPK1细胞胞质内发现被双层膜包裹细胞器自噬小体和自噬溶酶体。4.MDC染色检测自噬小体:merecidin处理细胞经MDC染色,在荧光显微镜下观察发现处理组A549和KO-MAPK1细胞质中大小不一、颗粒状绿色荧光。5.AO染色检测自噬溶酶体:merecidin处理A549细胞后经过AO染色,荧光显微镜下检测显示处理组A549和KO-MAPK1细胞核部分呈绿色荧光,细胞质部分呈红色荧光。6.CYTO-ID检测自噬小体及自噬溶酶体:merecidin作用于细胞后经CYTO-ID处理,荧光显微镜观检测显示处理组A549和KO-MAPK1细胞质内充满点状、颗粒状绿色荧光。7.Western blot检测蛋白表达:抗菌肽merecidin处理细胞后,Western blot结果检测显示:ATG5、ATG7、LC3II、ULK1、ATG13蛋白表达上调,P62、MAPK1蛋白表达下调。结论1.抗菌肽merecidin可诱导肺腺癌A549细胞发生自噬。2.抗菌肽merecidin通过MAPK1调控A549细胞自噬。

关键词：抗菌肽merecidin LL-37 蛋白质组自噬

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c-di-GMP的磷酸二酯酶PA4781在抗菌肽merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的作用

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微生物学通报 2020年第3期47卷 868-879页

作者：王雅蓉朱明星张帆杨婷婷贾琴琴王秀青宁夏医科大学临床医学院检验系宁夏银川750004 宁夏医科大学科技中心宁夏银川750004 宁夏医科大学总医院外科学研究室宁夏银川750004

【背景】抗菌肽merecidin可抑制临床菌株铜绿假单胞菌PA03生物被膜。PA4781基因是课题组通过生物信息学分析筛选出的差异表达基因,PA4781作为细菌第二信使分子环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)的磷酸二酯酶具有降解c-di-GMP的作... 详细信息

【背景】抗菌肽merecidin可抑制临床菌株铜绿假单胞菌PA03生物被膜。PA4781基因是课题组通过生物信息学分析筛选出的差异表达基因,PA4781作为细菌第二信使分子环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)的磷酸二酯酶具有降解c-di-GMP的作用,其在抗菌肽merecidin抑制生物被膜中的作用机制尚不清楚。【目的】研究细菌第二信使分子c-di-GMP的磷酸二酯酶PA4781基因在抗菌肽merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的作用。【方法】利用单碱基突变技术敲除PA4781基因,Sanger测序方法检测敲除的正确性。采用结晶紫染色法观察PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株24 h生物被膜生长情况,以及在抗菌肽merecidin 24、48、72μmol/L作用下各菌株生物被膜的生长情况。采用对羟基联苯溶液显色法检测在抗菌肽merecidin 48、72μmol/L作用下,PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜藻酸盐的变化情况。【结果】Sanger测序结果显示,用pnCasPABEC系统成功实现了靶点位置的单碱基突变,提前终止了PA4781的转录;结晶紫染色结果显示,培养24 h时,在24μmol/L抗菌肽merecidin作用下PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜形成情况无显著性差异(P>0.05),在抗菌肽merecidin 48、72μmol/L处理下,过表达株与正常株和敲除株有显著性差异(P抗菌肽merecidin浓度升高各组藻酸盐含量下降,其中过表达菌株在抗菌肽merecidin作用下藻酸盐生成量抑制率最高,可达65%。【结论】抗菌肽merecidin能够促进细菌第二信使分子磷酸二酯酶PA4781的表达,为抗菌肽merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜的作用机制可能通过细菌第二信使分子这一信号途径提供新的研究思路。

关键词：铜绿假单胞菌生物被膜抗菌肽merecidin 环二鸟苷酸单碱基突变

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