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转多个抗真菌蛋白基因水稻植株的获得及其抗稻瘟病菌的初步研究

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中山大学学报（自然科学版） 1999年第4期38卷 62-66页

作者：冯道荣卫剑文许新萍许耀李宝健中山大学生物工程研究中心

用基因枪法将水稻碱性几丁质酶（ＲＣ２４）基因、苜蓿葡聚糖酶（βＧｌｕ）基因、大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ）基因和潮霉素（ｈｐｔ）基因同时导入籼稻品种（七丝软占）中，获得了７个潮霉素抗性再生系，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌ... 详细信息

用基因枪法将水稻碱性几丁质酶（ＲＣ２４）基因、苜蓿葡聚糖酶（βＧｌｕ）基因、大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ）基因和潮霉素（ｈｐｔ）基因同时导入籼稻品种（七丝软占）中，获得了７个潮霉素抗性再生系，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明２～３个抗真菌蛋白基因已整合到水稻基因组中．

关键词：转基因水稻抗真菌蛋白基因基因枪抗稻瘟病菌

单当归酰基齐墩果烷茶皂苷元制备、半乳糖基化合成及其与抗稻瘟病菌活性的构效关系

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单当归酰基齐墩果烷茶皂苷元制备、半乳糖基化合成及其与抗稻瘟病...

作者：陈绪涛江西农业大学

学位级别：硕士

本实验室前期研究发现木荷叶齐墩果烷型皂苷具有强烈的抑制稻瘟病菌活性。构效关系显示C、C位的当归酰基,C位的糖基链与抑制稻瘟病菌活性关系密切。考虑到木荷叶皂苷含量低,难以获得足够量的苷元,同科植物油茶可望提供可替代的当归酰基... 详细信息

本实验室前期研究发现木荷叶齐墩果烷型皂苷具有强烈的抑制稻瘟病菌活性。构效关系显示C、C位的当归酰基,C位的糖基链与抑制稻瘟病菌活性关系密切。考虑到木荷叶皂苷含量低,难以获得足够量的苷元,同科植物油茶可望提供可替代的当归酰基齐墩果烷型皂苷,因此,本研究采用茶皂苷为起始物来实现其多样化的分子设计合成和构效关系研究。采用水浴提取,树脂吸附及沉析从茶饼粕中获得茶皂素;酸水解、溶剂萃取、柱层析等方法制备其茶皂苷元,色谱和波谱定性定量。结果显示,水提取条件为:料液比1:25(m/V)、80℃水浴,提取2 h,3次。纯化条件为:水提取液过AB-8型树脂,依次用水、稀碱、水和90%乙醇洗脱,醇洗脱液冰浴沉析3 h,离心获得茶皂素,纯度达96%。盐酸水解条件为:3 mol/L盐酸60%甲醇水溶液,料液比1︰15(m/V),85℃回流水解5 h;再进行乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析,收集石油醚-乙酸乙酯洗脱液,液相制备,获得一种茶皂素苷元,波谱数据并与文献比对,确定其结构为:21-当归酰基-22-(2-甲基丁酰基)茶皂苷元E(简称为:TS)。在外消旋樟脑磺酸催化下,利用苯甲醛二甲基缩醛对TS邻位伯仲羟基缩合保护,获得糖基受体1和受体2(分别命名简称为:TS1和TS2),以半乳糖三氯乙酰亚胺酯作为糖基供体,TMSOTf为催化剂,分别与TS1和TS2进行糖基化反应,共获得八种半乳糖基齐墩果烷型皂苷。通过分离纯化,H NMR和C NMR鉴定,它们的化学结构分别为:21-当归酰基-22-(2-甲基丁酰基)-16,28-O-亚苄基-茶皂苷元E-23-O-β-D-吡喃半乳糖苷、21-当归酰基-22-(2-甲基丁酰基)-16,28-O-亚苄基-茶皂苷元E-3-O-β-D-吡喃半乳糖-23-O-β-D-吡喃半乳糖苷、21-当归酰基-22-(2-甲基丁酰基)-3,23-O-亚苄基-茶皂苷元E-28-O-β-D-吡喃半乳糖苷、21-当归酰基-22-(2-甲基丁酰基)-3,23-O-亚苄基-茶皂苷元E-16-O-β-D-吡喃半乳糖-28-O-β-D-吡喃半乳糖苷、21-当归酰基-22-(2-甲基丁酰基)茶皂苷元E-23-O-β-D-吡喃半乳糖苷、21-当归酰基-22-(2-甲基丁酰基)茶皂苷元E-3-O-β-D-吡喃半乳糖-23-O-β-D-吡喃半乳糖苷、21-当归酰基-22-(2-甲基丁酰基)茶皂苷元E-28-O-β-D-吡喃半乳糖苷、21-当归酰基-22-(2-甲基丁酰基)茶皂苷元E-16-O-β-D-吡喃半乳糖-28-O-β-D-吡喃半乳糖苷分别命名为:TS1-Gal-1、TS1-Gal-2、TS2-Gal-1、TS2-Gal-2、TS1-Gal-1’’、TS1-Gal-2’、TS2-Gal-1’’、TS2-Gal-2’’。菌丝生长速率法测定茶皂素、茶皂苷元、受体1和2及其合成的半乳糖基齐墩果烷型皂苷的抗稻瘟病菌活性,它们的抗菌活性分别为:79.61%、42.45%、11.19%、30.98%、38.33%、23.87%、29.58%、4.91%、48.38%、29.64%、35.83%、26.16%,它们的构效关系为:(1)茶皂素C位侧链多糖基团对抗稻瘟病菌活性具有很重要的作用,当水解其多糖链时抑菌活性降低很多;(2)包埋茶皂苷元骨架上的羟基时,抑菌活性有不同程度的降低,尤其是同时包埋C与C位羟基;(3)当C、C位羟基缩合时,在C或C、C同时连接一个半乳糖时,活性有不同程度的增强,但未超过茶皂苷元;(4)当C、C位羟基缩合时,在C连接一个半乳糖时,活性有所下降但变化不明显,而C、C同时连接一个半乳糖时,活性直接几乎丧失;(5)脱除苄叉保护基后,活性都有所提高,其中C位连接一个半乳糖时,其活性提高最大,超过原料抗稻瘟病菌活性。因此,使茶皂苷元C、C位羟基裸露,同时增加C和C位糖基种类及其C位糖基的数量,将有效优化筛选出齐墩果烷型皂苷抗稻瘟病菌活性的分子设计方向,增加糖基化种类及其数量将需要进一步研究。

关键词：茶皂素茶皂苷元半乳糖苷化抗稻瘟病菌构效关系

齐墩果烷型皂苷修饰及其抗稻瘟病菌活性的构效关系

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齐墩果烷型皂苷修饰及其抗稻瘟病菌活性的构效关系

作者：肖大瑾江西农业大学

学位级别：硕士

稻瘟病是由稻瘟病菌引起的一种水稻灾难性病害,能使水稻严重减产。现阶段控制该病的化学农药不仅会对环境有较大的污染,也会引起稻瘟病菌产生抗药性,使病情更加难于防治。因此开发出环境友好型生物农药具有重要的价值和意义。本实验室... 详细信息

稻瘟病是由稻瘟病菌引起的一种水稻灾难性病害,能使水稻严重减产。现阶段控制该病的化学农药不仅会对环境有较大的污染,也会引起稻瘟病菌产生抗药性,使病情更加难于防治。因此开发出环境友好型生物农药具有重要的价值和意义。本实验室前期研究发现,木荷叶中所含的一种齐墩果烷型皂苷,具有强烈地抑杀稻瘟病菌活性。但其含量少,分离步骤繁琐,成本高昂,制约着其开发研究。因此,寻求可替代的结构类似物利用化学修饰的方法来制取多样化齐墩果烷型皂苷,以期筛选出抗稻瘟病菌活性的皂苷先导物。通过酸解茶皂素,然后过大孔树脂柱纯化,2次硅胶柱层析分离获得了一种单当归酰基齐墩果烷型苷元(TS);无患子醇提取获得无患子皂苷,再通过大孔树脂吸附纯化后,酸解过滤从而得到了常春藤苷元(无患子苷元,Hederagenin);纯化后的无患子皂苷在硅胶柱中进行了梯度洗脱,进而获得了5∶1流分的无患子皂苷;所获得的两种皂苷元,与三氯乙酰亚胺酯糖基供体发生糖基化反应,共获得了5种皂苷,通过C NMR和H NMR鉴定它们的化学结构。利用溴丙烯和7-溴-1-庚烯分别对5∶1流分无患子皂苷进行化学修饰,分别得到了混合皂苷A和混合皂苷B。用菌丝生长速率法测定了所分离和修饰的衍生物的抗稻瘟病菌活性。其抗稻瘟病菌活性分别为:46.52%(TS 100 ppm),17.57%(TS1 100 ppm),35.83%(TS2100 ppm),11.69%(TS1-Lac-1 100 ppm),9.82%(TS1-Lac-2 100 ppm),18.16%(TS2-Lac-1 100 ppm),18.16%(TS2-Lac-2 100 ppm),5.01%(Hederagenin-3-O-Lac100 ppm),66.74%(5∶1流分无患子皂苷50 ppm),82.83%(混合皂苷A 50 ppm),63.69%(混合皂苷B 50 ppm)。构效关系如下:(1)对皂苷抗稻瘟病菌效果影响最为巨大的为C3位,其中C3位糖基及其种类是主要的影响因素;(2)皂苷连接单糖链要优于双糖链,且糖链的位置连接在C3位置的效果较好;(3)皂苷E环和C28位亲油性基团可加强其抗稻瘟病菌活性,但影响效果不及C3位的糖基;(4)C15与C16的羟基也会有利于苷元的抗稻瘟病菌活性。

关键词：构效关系齐墩果烷型皂苷抗稻瘟病菌

齐墩果酸糖基化修饰及其抗稻瘟病菌活性的构效关系研究

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齐墩果酸糖基化修饰及其抗稻瘟病菌活性的构效关系研究

作者：惠亚勇江西农业大学

学位级别：硕士

稻瘟病是一种世界性的严重威胁水稻生产的三大病害之一,每年都造成水稻减产10%0%,并且降低水稻品质。而传统的化学农药存在着毒性大、污染环境和菌株易产生抗药性等缺点,因此,开发新型生物农药对防治稻瘟病具有重要意义。齐墩果酸是一... 详细信息

稻瘟病是一种世界性的严重威胁水稻生产的三大病害之一,每年都造成水稻减产10%0%,并且降低水稻品质。而传统的化学农药存在着毒性大、污染环境和菌株易产生抗药性等缺点,因此,开发新型生物农药对防治稻瘟病具有重要意义。齐墩果酸是一个分布广泛、含量丰富的五环三萜类化合物,具有显著的生物活性,通过糖基化在C-OH、C17-COOH和C12=C13等活性部分进行修饰合成其皂苷,不仅可以改善其极性小、水溶性差,生物利用度低的不足,而且还可以大大增强或增添新的生物活性,其中所合成皂苷的糖链结构和某些特定基团是活性的关键部位。本文从糖基、含功能基团糖链等糖基化修饰,齐墩果酸苷元改造等综述了已经人工合成的205种齐墩果烷型皂苷的结构特点及其生物活性,探讨了皂苷中糖基的种类、数量、连接方式、连接位置,以及特殊基团与α-葡糖苷酶抑制活性、溶血活性、癌细胞抑制活性、抗菌活性等的构效关系,以期为齐墩果烷型皂苷的新药(包括农用化学品)开发提供分子设计的思路。本文是以齐墩果酸为先导化合物,以糖基三氯乙酰亚胺酯和溴代糖苷作为糖基供体,分别对齐墩果酸的C-3羟基和C-28羧基进行糖基化修饰,通过1H NMR、13C NMR确认,共得到了26个齐墩果烷型三萜皂苷,包括3-单糖链皂苷14个,28-单糖链皂苷7个,3,28双糖链皂苷5个,其中,10个皂苷为首次人工合成,分别是齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖-28-烯丙醇酯(Rha-8),齐墩果酸3-O-α-D-吡喃甘露糖-28-烯丙醇酯(Man-8),α-D-吡喃甘露糖齐墩果酸酯(Man-11),齐墩果酸3-O-β-D-吡喃半乳糖-28-烯庚醇酯(Gal-8a),齐墩果酸3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-28-烯庚醇酯(Ara-8a),3-O-β-D-吡喃葡萄糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖齐墩果酸酯(HYY-1),3-O-β-D-吡喃木糖-28-O-ɑ-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸酯(HYY-2),3-O-β-D-吡喃半乳糖-28-O-ɑ-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸酯(HYY-3),3-O-ɑ-L-吡喃阿拉伯糖-28-O-β-D-吡喃半乳糖齐墩果酸酯(HYY-4),3-O-β-D-吡喃半乳糖-28-O-β-D-吡喃半乳糖齐墩果酸酯(HYY-5)。通过菌丝生长速率法测定了26种皂苷对稻瘟病菌的抑制活性。探讨了皂苷的糖基种类、糖基位置、糖链数量以及C-28位连接基团与稻瘟病菌抑制活性的构效关系:(ⅰ)齐墩果烷型皂苷对稻瘟病菌的抑制活性主要受糖基种类、糖基位置以及C-28位连接基团的综合影响;(ⅱ)齐墩果酸C-3位连接六碳糖有助于提高活性,连接甘露糖时活性最高;(ⅲ)齐墩果酸C-28位引入糖基和自由羧酸基一样均不利于提高抑菌活性;(ⅳ)齐墩果酸C-28位引入小分子酯链(如烯丙基)有助于提高皂苷抑菌活性;(ⅴ)齐墩果酸C-3位和C-28位同时引入糖基时,抑菌活性不变或降低;(ⅵ)我们认为,在齐墩果酸C-3位引入甘露糖等六碳糖,并增加C-3位糖分子的数目,同时C-28位连接小分子的酯链,是优化皂苷抗稻瘟病菌活性的分子设计方向,糖分子之间的连接方式还需进一步的研究。

关键词：齐墩果酸糖基化修饰抗稻瘟病菌构效关系