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转录后加工及修饰调控抗病毒天然免疫的研究进展

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中国科学：生命科学 2023年第11期53卷 1595-1612页

作者：元少春葛永凌韬徐安龙中山大学生命科学学院广州510275 北京中医药大学生命科学学院北京100029

流感病毒、新冠病毒、乙肝病毒、登革病毒等给人们生命健康带来严重危害的同时,也给全球经济带来巨大的冲击.因此,抗病毒天然免疫一直是免疫学及微生物学领域的研究热点.宿主免疫系统通过复杂的信号网络来感知这些病原体并启动针对感染... 详细信息

流感病毒、新冠病毒、乙肝病毒、登革病毒等给人们生命健康带来严重危害的同时,也给全球经济带来巨大的冲击.因此,抗病毒天然免疫一直是免疫学及微生物学领域的研究热点.宿主免疫系统通过复杂的信号网络来感知这些病原体并启动针对感染的免疫反应,在清除病毒感染的同时修复受损组织,维持机体免疫稳态.目前,越来越多的研究表明,包括转录后加工和修饰在内的表观遗传修饰在帮助机体启动抗病毒免疫并维持免疫稳态的同时,促进了病毒与宿主的协同演化.本文重点关注转录后加工和修饰,包括选择性剪接、选择性多聚腺苷化、RNA修饰和编辑等,如何在RNA层面调节宿主抗病毒免疫功能的发挥及病毒基因的表达.基于这些研究进展,本文探讨了病毒如何修改或利用转录后加工和修饰过程来逃避宿主免疫监测,以及转录后加工和修饰如何塑造宿主-病毒相互作用并介导二者之间的协同演化.最后,讨论了转录后加工修饰在病毒感染及其他免疫相关性疾病的诊疗以及mRNA疫苗开发中的应用前景.

关键词：转录后加工和修饰抗病毒天然免疫免疫逃逸宿主-病毒协同演化

呼吸道合胞病毒逃逸宿主抗病毒天然免疫的研究进展

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病毒学报 2024年

作者：黎婷朱惠芳赣南医科大学基础医学院赣南医科大学第一附属医院儿童医学研究所

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是引起呼吸道感染性疾病的主要病原，几乎所有成人在儿童时期都经历过RSV的感染、甚至反复感染。RSV原发性感染通常导致下呼吸道的细支气管炎和肺炎，全世界每年超过300万人住院，约... 详细信息

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是引起呼吸道感染性疾病的主要病原，几乎所有成人在儿童时期都经历过RSV的感染、甚至反复感染。RSV原发性感染通常导致下呼吸道的细支气管炎和肺炎，全世界每年超过300万人住院，约66 000人死亡，是威胁人类健康以及全球公认的疾病负担沉重的公共卫生问题。在RSV感染过程中，天然免疫是抑制病毒感染和复制的第一道防线。然而，在与宿主长期的博弈过程中，RSV进化出多种机制来逃避宿主的天然免疫监控，从而在机体中建立有效的感染。本文系统综述了在RSV感染过程中，宿主天然免疫系统对病毒的免疫识别作用，以及病毒的天然免疫逃逸机制，不仅能全面认识病毒与宿主天然免疫之间的相互关系，而且为抗RSV感染的药物治疗以及疫苗的开发提供新思路。

关键词：呼吸道合胞病毒抗病毒天然免疫 I型干扰素免疫逃逸模式识别受体

内质网应激在抗病毒天然免疫应答中的研究进展

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医学研究生学报 2022年第3期35卷 318-324页

作者：李正方钱(综述) 陈涛涌(审校) 海军军医大学免疫学研究所暨医学免疫学国家重点实验室上海200433

内质网应激是在细胞内蛋白稳态失调时所诱发的一种应激反应方式,大量未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网中蓄积,引发内质网应激。研究表明,病毒感染造成的内质网应激在抗病毒天然免疫中发挥双重作用:一方面,细胞可通过内质网应激所引发... 详细信息

内质网应激是在细胞内蛋白稳态失调时所诱发的一种应激反应方式,大量未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网中蓄积,引发内质网应激。研究表明,病毒感染造成的内质网应激在抗病毒天然免疫中发挥双重作用:一方面,细胞可通过内质网应激所引发的未折叠蛋白反应抑制病毒复制,增强炎症反应的强度;另一方面,病毒也可利用未折叠蛋白反应促进其自身的复制,并通过对未折叠蛋白反应的调控,抑制抗病毒天然免疫应答及炎症反应,维持病毒感染。文章就近年来内质网应激在抗病毒天然免疫应答中的作用和分子机制方面的研究进展进行综述。

关键词：内质网应激抗病毒天然免疫未折叠蛋白反应病毒感染

NRF1抑制RNA病毒诱导的抗病毒天然免疫反应

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复旦学报（自然科学版） 2019年第4期58卷 467-472,481页

作者：齐飞周斌韩旭凌李鹏程武舫伊钱峰复旦大学生命科学学院上海200438 复旦大学现代人类学教育部重点实验室上海200438

核呼吸因子NRF1是调控细胞生长、代谢能量产生、线粒体氧化呼吸链重要基因表达的转录因子,但是在免疫中的作用尚未被报道.本研究发现NRF1参与抗病毒天然免疫应答.在NRF1敲低的HEK293T细胞中,病毒复制能力减弱.过表达NRF1抑制病毒诱导Ⅰ... 详细信息

核呼吸因子NRF1是调控细胞生长、代谢能量产生、线粒体氧化呼吸链重要基因表达的转录因子,但是在免疫中的作用尚未被报道.本研究发现NRF1参与抗病毒天然免疫应答.在NRF1敲低的HEK293T细胞中,病毒复制能力减弱.过表达NRF1抑制病毒诱导Ⅰ型干扰素的产生.为进一步研究NRF1调节免疫应答的功能,利用双荧光素酶报告基因实验,发现过表达NRF1抑制了IRF3或其上游信号分子介导的Ⅰ型干扰素的激活,免疫共沉淀的方法表明NRF1与IRF3存在相互作用.这是我们首次报道NRF1在天然免疫中的新功能.

关键词：核呼吸因子1 抗病毒天然免疫 Ⅰ型干扰素干扰素调节因子3

ZDHHC3在抗病毒天然免疫RLR信号通路中的作用机制

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ZDHHC3在抗病毒天然免疫RLR信号通路中的作用机制

作者：易李福建医科大学

学位级别：硕士

蛋白质翻译后修饰是蛋白质翻译后的重要过程。近年来研究发现蛋白质的棕榈酰化修饰可以通过调控底物蛋白的定位、构象、活性、稳定性和蛋白间的相互作用从而影响底物蛋白的功能。棕榈酰化是一种可逆的脂质修饰,是蛋白质棕榈酰化与去棕... 详细信息

蛋白质翻译后修饰是蛋白质翻译后的重要过程。近年来研究发现蛋白质的棕榈酰化修饰可以通过调控底物蛋白的定位、构象、活性、稳定性和蛋白间的相互作用从而影响底物蛋白的功能。棕榈酰化是一种可逆的脂质修饰,是蛋白质棕榈酰化与去棕榈酰化交替循环的动态过程,主要由蛋白质酰基转移酶和酰基蛋白质硫酯酶介导该动态修饰。其中催化棕榈酰化这一修饰的酶含有一个锌指-DHHC结构域,因此又称为ZDHHC酶。目前研究发现人体内存在23种ZDHHC蛋白,可以介导细胞内蛋白的棕榈酰化修饰。研究已报道一些ZDHHC家族蛋白在DNA病毒识别信号通路中发挥重要作用。此外,有文章报道棕榈酰化修饰可以调控RNA病毒感染诱导的抗病毒天然免疫,但是其潜在的分子机制尚不清楚。目的:本研究旨在探索ZDHHC3在抗病毒天然免疫RLR信号通路中的调控机制,将为研究棕榈酰化修饰调控抗病毒天然免疫信号通路及寻找新的抗病毒药物作用靶点提供科学理论基础。方法:1.确定ZDHHC3在抗病毒天然免疫RLR信号通路中的作用。构建ZDHHC3表达质粒并进行DNA测序和WB(Western blotting)验证。通过双荧光素酶报告基因系统,检测ZDHHC3对RIG-I-N诱导的IFN-β启动子活性的调控作用;通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q RT-PCR)检测ZDHHC3对RLR信号通路激活后的IFN-β以及ISG54/56 m RNA水平表达的影响;HEK293T细胞转染ZDHHC3、IRF3-YFP质粒,并激活RLR天然免疫信号通路,通过免疫荧光实验,检测ZDHHC3对IRF3入核的影响。2.确定ZDHHC3在RLR信号通路中作用的靶蛋白。通过DLR(dual-luciferase reporter assay)技术确认ZDHHC3在RLR天然免疫信号通路中的作用靶点,并在HEK293T细胞和THP-1细胞中,利用免疫共沉淀实验对ZDHHC3和线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)进行相互作用分析;通过免疫荧光共聚焦技术,检测ZDHHC3与MAVS之间共定位情况。3.利用WB检测ZDHHC3对MAVS或RLR信号通路其他蛋白是否存在特异性调控作用。4.探索ZDHHC3对MAVS的潜在作用机制。在HEK293T细胞中,转染WT-Ub/K63-Ub/K48-Ub、MAVS、ZDHHC3以及对照空载体质粒,利用WB技术检测ZDHHC3对MAVS的泛素化调控作用。5.通过CRISPR/Cas9系统构建ZDHHC3敲除细胞系和ZDHHC3敲低细胞系,同时用PCR、WB、DNA测序等方法进一步验证基因敲除或敲低效果;利用RIG-I-N和RNA病毒感染激活RLR信号通路,通过q RT-PCR检测野生型细胞系与ZDHHC3敲除细胞系的IFN-β、ISG54/56基因的m RNA表达水平;利用WB方法检测野生型和ZDHHC3敲低细胞系对RNA病毒感染诱导激活的TBK1磷酸化的影响以及病毒复制能力的影响。6.使用棕榈酰化抑制剂2-BP,利用DLR检测ZDHHC3的抑制作用是否依赖于其酶活性。结果:1.超表达ZDHHC3明显抑制由RIG-I-N激活的IFN-β启动子活性,ZDHHC3明显下调RIG-I-N和Se V激活的IFN-β、ISG54/56基因的m RNA水平,且ZDHHC3明显影响RIG-I-N激活的IRF3入核效应。***3与MAVS呈现明显共定位,且两者存在相互作用。***3影响MAVS蛋白表达水平,但是ZDHHC3对MAVS的m RNA表达水平没有影响。ZDHHC3不影响RLR信号通路其他接头蛋白RIG-I、TBK1、IRF3的蛋白水平。***3通过影响MAVS的泛素化修饰从而抑制MAVS的激活。5.敲除和敲低ZDHHC3均能增强RLR信号通路介导的抗病毒免疫活性。6.在超表达ZDHHC3的情况下,2-BP处理能略微上调由RIG-I-N激活的IFN-β启动子活性,但是ZDHHC3抑制作用并没有出现明显消失。结论:***3特异性降解MAVS,从而负调节由RIG-I-N和Se V诱导激活的固有免疫应答。***3通过促进MAVS的泛素化进而影响了MAVS的激活,且不依赖于酶活性。3.敲除和敲低ZDHHC3均促进了RIG-I-N和Se V诱导激活的固有免疫应答。

关键词： ZDHHCs MAVS 抗病毒天然免疫蛋白质翻译后修饰

USP5靶向IRF3负向调控抗病毒天然免疫应答及其机制研究

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USP5靶向IRF3负向调控抗病毒天然免疫应答及其机制研究

作者：乔子刚扬州大学

学位级别：硕士

天然免疫是宿主抵抗病毒入侵的第一道防线,病毒核酸可以被模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别,活化转录因子IRF3,IRF3被激活后发生磷酸化和二聚化后入核,进而形成有活性的转录复合体,启动Ⅰ型干扰素(Type Ⅰ Interfe... 详细信息

天然免疫是宿主抵抗病毒入侵的第一道防线,病毒核酸可以被模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别,活化转录因子IRF3,IRF3被激活后发生磷酸化和二聚化后入核,进而形成有活性的转录复合体,启动Ⅰ型干扰素(Type Ⅰ Interferon,IFN-I)的基因转录,继而诱导大量IFN-I依赖的抗病毒蛋白,从而起到抗病毒作用。但同时IFN-I的过量产生会导致许多自身免疫性疾病及自身炎症性疾病的发生,所以IFN-I的表达及下游信号的活化必须受到精确调控。过去十年来的研究已充分证明翻译后修饰,尤其是泛素化修饰,在激活和调节IFN-I信号转导中起关键作用。而去泛素化酶(deubiquitinases,DUB)是与泛素化相关的一类蛋白酶,它能够逆转底物蛋白质的泛素化修饰,从而调节细胞功能。在抗病毒天然免疫中相较于E3泛素连接酶介导的泛素化修饰,去泛素化酶的相关研究仍然较少,很多参与调控抗病毒免疫的DUB分子还未被发现。在本课题中我们试图找到一些能够参与调控抗病毒天然免疫的DUB分子,为感染性疾病的诊治提供新的靶点。通过比对GEO数据库中VSV病毒感染A549细胞,以及ZIKA病毒感染人树突状细胞后DUB分子表达水平的测序结果,我们得到了许多与抗病毒天然免疫相关的DUB分子。经过实时荧光定量PCR和Western blot进一步确定了一个去泛素化酶USP5在VSV,SeV和WSN病毒感染后表达显著下调。后续经过USP5的高表达、敲低及敲除实验,利用实时荧光定量PCR、流式细胞分析和荧光显微镜证明USP5能够通过抑制IFN-I的产生,从而显著促进VSV、SeV和WSN病毒的复制。为了探究USP5发挥抗病毒作用的分子机制,我们首先利用实时荧光定量PCR证明IFN-β以及病毒模拟物polyI:C和polydA:dT能够抑制USP5的表达,接着在VSV病毒感染以及polyI:C刺激的Ifnar1-/-和Ifnb-/-小鼠中,证明IFN-I参与调控USP5表达。同时我们通过IFN-β启动子、ISRE启动子的荧光素酶报告基因实验确定了 USP5能够靶向IRF3,抑制IFN-β的产生。邻近连接实验和免疫共沉淀实验证实USP5能与IRF3发生相互作用,特异性去除IRF3上K48连接的多聚泛素化修饰。然后利用免疫荧光技术我们又发现USP5能够抑制IRF3的核转运。最终我们证明了 IFN-I能够调控USP5的表达,同时USP5能通过特异去除IRF3上K48连接的多聚泛素化修饰以及影响IRF3的核转运过程,来抑制IFN-I的合成,促进RNA病毒的感染。综上所述,我们的研究证明IFN-I参与调节USP5的表达,同时USP5能够精确调控IFN-I,参与抗病毒免疫应答。本研究为深入了解DUB在抗病毒天然免疫中的作用奠定了理论基础,为自身免疫性疾病和自身炎症性疾病的治疗提供了潜在的靶点,同时也为感染性疾病的防治提供了新思路。

关键词：抗病毒天然免疫 USP5 IRF3 泛素化修饰感染性疾病

USP49通过去泛素化MITA负调控抗病毒天然免疫反应的机制研究

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USP49通过去泛素化MITA负调控抗病毒天然免疫反应的机制研究

作者：叶莉亚武汉大学

学位级别：硕士

病毒感染与复制中产生的病原相关分子模式(PAMPs),如RNA、DNA、RNADNA杂合体可以被模式识别受体(PRRs)识别,随后模式识别受体发生构象变化,招募接头蛋白或催化第二信使招募并激活接头蛋白,进而诱导发生一系列信号级联反应,最终介导信号... 详细信息

病毒感染与复制中产生的病原相关分子模式(PAMPs),如RNA、DNA、RNADNA杂合体可以被模式识别受体(PRRs)识别,随后模式识别受体发生构象变化,招募接头蛋白或催化第二信使招募并激活接头蛋白,进而诱导发生一系列信号级联反应,最终介导信号转导与抗病毒天然免疫应答。有研究显示,胞浆中的DNA可以被cGAS识别,cGAS催化ATP和GTP产生cGAMP,cGAMP继而与MITA相结合并激活MITA,从而激活下游信号通路产生I型干扰素和炎症因子。MITA敲除小鼠对HSV-1感染更加敏感,在MITA敲除小鼠的细胞中,HSV-1感染或转染dsDNA后,IRF3的磷酸化以及下游基因的表达几乎完全受到抑制,这些实验说明MITA是介导胞内DNA信号转导的关键蛋白,在抗病毒天然免疫信号通路中发挥着关键的作用。MITA的功能受到各种翻译后修饰的调控,其中包括泛素化和去泛素化修饰。近年来,大量研究报道了E3泛素连接酶在MITA介导的信号通路中发挥的作用及机制。然而,到目前为止,我们对MITA的去泛素化过程、相关的功能与机制尚不完全清楚。为了进一步了解去泛素化作用对MITA调控的信号通路的影响,我们筛选了与MITA存在潜在相互作用的去泛素化酶,结果显示USP49与MITA存在相互作用,并且,两者的相互作用受HSV-1、dsDNA或cGAMP的诱导。在THP-1细胞中敲低或敲除USP49可以促进MITA介导的信号通路的激活。Usp49敲除小鼠的细胞受HSV-1、dsDNA或cGAMP诱导产生的I型干扰素和炎症因子的表达显著升高,病毒复制的强度显著降低,Usp49敲除小鼠对HSV-1的感染更加抵抗。机制研究结果表明,在HSV-1感染之后,USP49能够特异性去除MITA上K63-连接的泛素链修饰,抑制MITA的寡聚化,进而抑制MITA对下游激酶TBK1的招募以及抗病毒天然免应答。以上研究揭示了USP49在抗病毒天然免疫应答中发挥的重要作用,并且为研究MITA介导的信号通路的调控机制提供了新的思路。

关键词： USP49 MITA 抗病毒天然免疫泛素化

谷氨酰胺调控猪肠道抗病毒天然免疫的分子机制

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谷氨酰胺调控猪肠道抗病毒天然免疫的分子机制

作者：焦珂湖南师范大学

学位级别：硕士

天然免疫在人和动物机体稳态中发挥重要作用。近年来维生素,植物提取物,营养素如氨基酸等在调节免疫方面的研究越来越引起重视。谷氨酰胺,作为体内含量最丰富的氨基酸,在生物体内具有很多的生理功能。然而关于谷氨酰胺是否调节天然免疫... 详细信息

天然免疫在人和动物机体稳态中发挥重要作用。近年来维生素,植物提取物,营养素如氨基酸等在调节免疫方面的研究越来越引起重视。谷氨酰胺,作为体内含量最丰富的氨基酸,在生物体内具有很多的生理功能。然而关于谷氨酰胺是否调节天然免疫及其潜在机制的研究知之甚少。本研究以猪肠上皮细胞（IPECJ2）为研究模型,荧光定量的结果表明谷氨酰胺处理后RIG-I（P＜0.01）和IFNβ（P＜0.01）基因的表达显著上调。抗病毒实验表明谷氨酰胺使病毒复制和病毒滴度均减弱。进一步探究谷氨酰胺抗病毒的分子机制,Western blot结果显示谷氨酰胺激活了TBK1和IRF3。此外,分别通过构建IRF3敲低细胞系和使用TBK1的抑制剂进行实验,结果均表明RIG-I和IFNβ基因表达下调。由于mTORC1在氨基酸感知信号通路中的重要作用,我们对mTORC1是否参与谷氨酰胺激活的抗病毒信号通路进行探究。通过Western blot检测到mTORC1下游蛋白s6k的磷酸化,使用mTORC1的抑制剂和构建mTORC1的敲低细胞系均显著减弱谷氨酰胺对RIG-I和IFNβ基因上调的作用。这些结果证明了mTORC1确实参与了谷氨酰胺激活的抗病毒天然免疫信号通路。为了进一步探究参与到谷氨酰胺抗病毒信号通路中的TBK1/IRF3和mTORC1的上下游关系,我们分别用mTORC1的抑制剂和mTORC1敲低细胞系对IRF3和TBK1的活化进行检测。结果发现,抑制或降低mTORC1的表达,IRF3和TBK1的磷酸化水平均降低,表明活化减弱。结果证明了mTORC1位于TBK1/IRF3信号通路的上游。综上所述,本研究表明在猪肠上皮细胞中,谷氨酰胺通过mTORC1介导的TBK1-IRF3信号通路,上调干扰素基因的表达,激活抗病毒天然免疫。研究结果揭示了谷氨酰胺激活抗病毒天然免疫及其机制,为抗病毒天然免疫的营养调控策略提供理论基础和实验依据。

关键词：谷氨酰胺抗病毒天然免疫 mTORC1 IRF3

亮氨酸调控猪肠道抗病毒天然免疫的分子机制研究

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亮氨酸调控猪肠道抗病毒天然免疫的分子机制研究

作者：王香香湖南师范大学

学位级别：硕士

亮氨酸作为一种功能性氨基酸,在生物体内有众多的生理学功能,本研究拟通过体外细胞实验探究亮氨酸调控细胞抗病毒天然免疫的作用及其分子机制。本课题研究以猪的肠上皮细胞(IPEC-J2)为试验对象研究亮氨酸调控天然免疫的分子机制,我们发... 详细信息

亮氨酸作为一种功能性氨基酸,在生物体内有众多的生理学功能,本研究拟通过体外细胞实验探究亮氨酸调控细胞抗病毒天然免疫的作用及其分子机制。本课题研究以猪的肠上皮细胞(IPEC-J2)为试验对象研究亮氨酸调控天然免疫的分子机制,我们发现亮氨酸在猪肠上皮细胞中可以诱导IFN-β、RIG-I等PRRs基因的表达,并正向调节宿主抗病毒反应。为了研究Sestrin2-mTORC1、IRF3是否参与亮氨酸调控抗病毒天然免疫过程,我们通过shRNA干扰技术敲低IRF3、Sestrin2、mTORC1的表达。我们发现亮氨酸激活IRF3通路,正向调节IFN-β和PRRs基因的表达;同时,Sestrin2参与亮氨酸诱导的肠上皮细胞mTORC1活化,抑制宿主肠上皮细胞抗病毒反应,并且抑制亮氨酸诱导的先天免疫相关基因的表达。这表明mTORC1可能参与亮氨酸调控抗病毒天然免疫应答。我们敲低mTORC1后,发现IFN-β、RIG-I、MDA-5和TLR-3基因表达量下降,同时,在添加rapamycin处理组结果发现IRF3的活化也收到抑制,这些结果表明mTORC1对亮氨酸诱导的IRF3活化至关重要。综上所述,在猪肠上皮细胞中,亮氨酸可以通过Sestrin2-mTORC1信号通路调控转录因子IRF3的活化,并且能够激活抗病毒天然免疫。

关键词：亮氨酸 Sestrin2 mTORC1 抗病毒天然免疫