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1 特异性结合DON抗原—抗体免疫复合物纳米抗体的淘选、鉴定及表达 2 基于噬菌体展示纳米抗体的定量免疫PCR检测Bt蛋白Cry1Ac方法的建立

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1 特异性结合DON抗原—抗体免疫复合物纳米抗体的淘选、鉴定及表...

作者：刘园园南昌大学

学位级别：硕士

第一部分相对于竞争型免疫分析体系,非竞争型免疫分析方法具有操作简单、灵敏度高以及检测范围广等优点。然而,对于小分子物质而言,由于小分子物质的分子量及结合表位较小,难以直接被两个常规抗体同时结合,因此目前小分子物质的免疫分... 详细信息

第一部分相对于竞争型免疫分析体系,非竞争型免疫分析方法具有操作简单、灵敏度高以及检测范围广等优点。然而,对于小分子物质而言,由于小分子物质的分子量及结合表位较小,难以直接被两个常规抗体同时结合,因此目前小分子物质的免疫分析体系大多以竞争型为主。本研究以食品中常见的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)为小分子物质的研究模型,在形成DON抗原-抗体免疫复合物的基础上,投入天然噬菌体展示纳米抗体库,亲和淘选可特异性结合DON抗原-抗体复合物的噬菌体展示纳米抗体,经Phage-ELISA验证后,开展纳米抗体的可溶性原核表达,为建立基于纳米抗体的DON非竞争型免疫分析体系提供了一种新的途径和有效探索。本研究取得的主要实验结果如下:1.可特异性结合DON抗原-抗体免疫复合物纳米抗体的亲和淘选及鉴定以DON为研究对象,DON抗原-抗体免疫复合物作为靶标,经过四轮亲和淘选,从驼源天然噬菌体展示纳米抗体库中首次获得4种可特异性结合DON抗原-抗体免疫复合物的纳米抗体,经DNA测序分析后,分别命名为P-1、P-19、P-26、P-46,Phage-ELISA结果显示,上述纳米抗体对DON抗原-抗体复合物具有良好的结合特异性;建立了基于噬菌体展示纳米抗体(P-26)的非竞争型免疫分析DON曲线,结果显示:当DON标准品的浓度在000 ng/mL区间时,投入了所获噬菌体展示纳米抗体的对应板孔,其OD值随着加入的DON浓度增加而相应地提高,表明所获得的噬菌体展示纳米抗体对DON抗原-抗体复合物具有较好的结合响应度,但未呈现典型的线性曲线。2.可特异性结合DON抗原-抗体免疫复合物纳米抗体的原核表达通过分子克隆技术,提取P-1、P-19、P-26、P-46的VHH编码基因,将编码基因克隆至pET25b(+)原核表达载体上,经DNA测序验证,成功构建了重组表达载体pET25b-VHH-P-1、pET25b-VHH-P-19、pET25b-VHH-P-26和pET25b-VHH-P-46,并转化至*** Rosetta细胞;在1%葡萄糖,0.05 mM IPTG下诱导表达8 h,经镍柱纯化,并用50 Mm咪唑洗脱后,获得4种可溶性的纳米抗体N-1、N-19、N-26、N-46。建立了基于可溶性纳米抗体(N-26)的DON非竞争型免疫分析反应曲线,当DON标准品的浓度在800 ng/mL区间时,投入了纳米抗体的对应板孔,其OD值随着加入的DON浓度增加而相应地提高,表明所获得的可溶性纳米抗体对DON抗原-抗体复合物具有较好的结合响应度,为下一步开展DON的非竞争型免疫分析体系的建立提供了重要研究材料及有效地探索。第二部分Cry1Ac是一种常见的Bt(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白,现已广泛应用于抗虫转基因作物,比如大豆、棉花、水稻、小麦等。随着众多转基因农作物的逐渐商业化,市场上的转基因食品日益增多,同时转基因食品的安全性也逐渐受到大众的关注及重视,因此对食品中的转基因成分进行检测就显得十分重要。目前转基因成分(Genetically modified ingredients,GMO)的检测主要包括基于蛋白质检测的免疫分析以及基于核酸检测的PCR(Polymerase chain reaction,PCR)分析两大类。免疫分析具有特异性高、操作简单以及可高通量筛选等优点,然而由于其自身信号扩增体系的局限性,也存在着灵敏度不高、假阳性较多等缺陷。本研究在获得可特异性结合Cry1Ac蛋白的噬菌体展示纳米抗体的基础上,将免疫分析与核酸分析的技术优势进行综合,建立基于噬菌体DNA信号扩增体系的免疫PCR分析Cry1Ac蛋白方式,主要实验结果如下:1.针对抗Cry1Ac噬菌体展示纳米抗体编码基因的CDR3区设计了特异性的PCR扩增引物,成功地扩增了纳米抗体的CDR3区(98 bp),为噬菌体展示纳米抗体的特异性信号扩增奠定了基础。2.将抗Cry1Ac单克隆抗体(8A8)作为捕获抗体,抗Cry1Ac噬菌体展示纳米抗体(P-72)作为检测抗体,建立了转基因蛋白Bt-Cry1Ac的免疫PCR检测方法。该方法的拟合标准曲线结果显示,其线性相关系数为0.9968,线性范围为0.00100 ng/mL,最低检测限为0.094 pg/mL;该方法对于Cry1Ac的同源蛋白Cry1Ab的交叉反应率为3.4%,对其它杂类蛋白质无交叉反应,具备良好的检测特异性;加标回收实验结果显示,该方法用于检测Bt-Cry1Ac的加标回收率为78.8146%,变异系数CV(%)范围6.131.92,表明该方法具有较好的准确性及重现性。

关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇纳米抗体抗原-抗体复合物非竞争型免疫分析 Bt-Cry1Ac 定量免疫PCR

妊娠期高血压疾病患者抗滋养细胞抗体及循环免疫复合物水平与其病变程度的研究

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妊娠期高血压疾病患者抗滋养细胞抗体及循环免疫复合物水平与其病...

作者：刘艳妮吉林大学

学位级别：硕士

目的:通过测定妊娠期高血压疾病患者母血及脐血中的抗滋养细胞(TA)抗体及循环免疫复合物(CIC),分析抗滋养细胞抗体及循环免疫复合物在妊娠期高血压疾病发病机制中的作用及其与病变的相关性。材料与方法:选取90例妊娠期高血压疾病患者,... 详细信息

目的:通过测定妊娠期高血压疾病患者母血及脐血中的抗滋养细胞(TA)抗体及循环免疫复合物(CIC),分析抗滋养细胞抗体及循环免疫复合物在妊娠期高血压疾病发病机制中的作用及其与病变的相关性。材料与方法:选取90例妊娠期高血压疾病患者,轻度子痫前期24例,重度子痫前期45例,子痫21例;对照组为30例正常分娩患者。收集入院待产患者静脉血5毫升,于分娩时收集脐静脉血5毫升,离心收集血清;用酶联免疫吸附法(ELISA)间接检测血清抗滋养细胞抗体;用PEG免疫散射比浊法测血清中循环免疫复合物。以SPSS统计软件进行分析。结果:(1)母血中抗TA IgG,IgM的阳性率在妊娠期高血压疾病患者组均高于正常对照组,具有统计学意义(p0.05)。(2)脐血中抗TA IgG,IgM妊娠期高血压疾病组显著高于对照组(p0.05)。(3)CIC在妊娠期高血压疾病患者母血中的阳性率显著高于正常对照组(p0.05)。结论:本研究证明妊娠期高血压疾病患者血中抗TA IgG,IgM及CIC表达水平均升高,这些免疫产物引起胎盘及各器官的免疫损伤,在妊娠期高血压疾病的发生发展中,具有重要作用。

关键词：妊娠并发症高血压子痫滋养细胞抗原-抗体复合物

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新型升血小板因子的免疫原性实验研究

免疫学杂志 2005年第6期21卷 471-473页

作者：邵波艾国平王军平刘晓宏肖燕开丽粟永萍第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所

目的明确自行研制的新型升血小板因子是否具有免疫原性。方法分别用佐剂、新型升血小板因子+佐剂、新型升血小板因子、鸡卵清蛋白+佐剂免疫Balb/c小鼠,采用琼脂免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中的抗体。结果ELISA... 详细信息

目的明确自行研制的新型升血小板因子是否具有免疫原性。方法分别用佐剂、新型升血小板因子+佐剂、新型升血小板因子、鸡卵清蛋白+佐剂免疫Balb/c小鼠,采用琼脂免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中的抗体。结果ELISA法未检测到血清中的抗体;琼脂免疫扩散试验血清经72h扩散观察未出现沉淀线,没有形成抗原抗体复合物。结论用新型升血小板因子免疫Balb/c小鼠,未发现能够刺激小鼠产生抗新型升血小板因子抗体。

关键词：新型升血小板因子免疫原性抗原-抗体复合物

内因性色素膜炎患者循环免疫复合物及其特异性研究

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中华眼科杂志 1991年第4期27卷 231-234页

作者：张铭端黄叔仁本溪钢铁公司职工总医院眼科安徽医科大学第一附属医院眼科

对77例内因性色素膜炎(endogenous uveitis,EU)患者的循环免疫复合物(circulating im-mune complex,CIC)水平作了动态研究。结果表明:EU 患者 CIC 水平明显升高(P0.05)。77例 EU患者中有29例(37.7%)CIC 阳性,尤以急性前色素膜炎患者阳... 详细信息

对77例内因性色素膜炎(endogenous uveitis,EU)患者的循环免疫复合物(circulating im-mune complex,CIC)水平作了动态研究。结果表明:EU 患者 CIC 水平明显升高(P0.05)。77例 EU患者中有29例(37.7%)CIC 阳性,尤以急性前色素膜炎患者阳性率最高(58.6%)。同时在9例患者的CIC 中检测到视网膜可溶性抗原(S-Ag)。EU 患者的血清 C3水平亦明显降低,并与 CIC 水平相关.痊愈后也恢复正常。这表明 CIC 在 EU 发病机理中有重要作用。我们对 EU 的免疫学发病机理及动态观察 CIC 水平的临床意义进行了讨论。

关键词：葡萄膜炎抗原-抗体复合物抗原,可溶性

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心肌炎

高血压杂志 2005年第9期13卷 582-583页

问:感染性心肌炎时,心肌细胞受损的机制?答:1.感染细菌,病毒直接侵入;2.心肌毒素;3.免疫反应介导的损害;心肌炎主要原因是病毒,最可能机制是免疫反应,如病毒产生新的细胞表面抗原,或抗原抗体复合物有关的细胞损害.

关键词：感染性心肌炎抗原-抗体复合物免疫反应介导细胞表面抗原细胞损害心肌细胞感染细菌可能机制病毒

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葛根素致急性肾衰竭1例与发病机制探讨

医药导报 2012年第4期31卷 535-536页

作者：许焱史振伟煤炭总医院肾内科北京100028

目的探讨葛根素导致急性肾衰竭的可能发病机制。方法报道1例葛根素导致急性肾衰竭、急性血管内溶血的病案,并结合近年文献进行复习及分析。结果患者应用葛根素治疗中迅速出现肾功能恶化、血红蛋白下降,肾活检结果为系膜细胞和基质轻度增... 详细信息

目的探讨葛根素导致急性肾衰竭的可能发病机制。方法报道1例葛根素导致急性肾衰竭、急性血管内溶血的病案,并结合近年文献进行复习及分析。结果患者应用葛根素治疗中迅速出现肾功能恶化、血红蛋白下降,肾活检结果为系膜细胞和基质轻度增生,部分肾小管可见裸基底膜,肾间质轻度水肿,少量淋巴细胞和单核细胞浸润;免疫荧光提示IgM(±)、IgA、IgG、C3、C1q、FRA均阴性。行血清葛根素抗体检测(GGS模拟试验),结果提示患者血清中存在GGS依赖性抗体,以IgM类型为主,并有补体活化现象。结论葛根素导致急性肾衰竭的最主要机制为急性肾小管坏死,但是药物诱导的抗原-抗体复合物形成并沉积在肾小球或诱发机体产生超敏反应导致的肾小球或肾间质损伤也可能参与或加重急性肾衰竭。

关键词：葛根素肾衰竭,急性肾小管坏死,急性抗原-抗体复合物

结核分枝杆菌c-di-GMP代谢相关蛋白的生物化学研究的功能衰退

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结核分枝杆菌c-di-GMP代谢相关蛋白的生物化学研究的功能衰退

作者：王琳中国科学技术大学

学位级别：硕士

结核病是严重危害人类健康的传染病,由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)慢性感染引起,是目前传染病中仅次于艾滋病的第二号杀手。到目前为止,包括研究最深入的结核分枝杆菌菌株H37Rv在内的多个菌株已经被测序,为我们进行... 详细信息

结核病是严重危害人类健康的传染病,由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)慢性感染引起,是目前传染病中仅次于艾滋病的第二号杀手。到目前为止,包括研究最深入的结核分枝杆菌菌株H37Rv在内的多个菌株已经被测序,为我们进行结核分枝杆菌的生物学研究,以及发展新的预防治疗结核方法提供了良好的基础。环二鸟苷酸(c-di-GMP)是近十余年发现的细菌胞内第二信使,由二分子cGMP通过3′,5?-磷酸二酯键连接而成,在P. aeruginosa、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等G?细菌和S. aureus等G+细菌中广泛存在。近年来,随着微生物基因组的大规模测序,环二鸟苷酸(c-di-GMP)吸引了越来越多的关注。c-di-GMP在细胞内的水平分别受到含GGDEF结构域(二鸟苷酸环化酶活性)和EAL结构域(磷酸二酯酶活性)蛋白的正向和负向调节,是原核生物中普遍存在的多细胞行为调节因子,通过多种交叉信号网络调控生物膜形成、耐药性、毒力因子表达等生理过程。

关键词： S-腺苷甲硫氨酸甲基化转移酶单体结构重排单链抗体单链嵌合抗体抗原-抗体复合物古细菌转录因子 X-射线衍射晶体结构

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吸入二异氰酸甲苯酯气道致敏六例临床分析

职业卫生与应急救援 1995年第3期13卷 137-138页

作者：汤厥铭上海市化工职业病防治研究所

吸入二异氰酸甲苯酯气道致敏六例临床分析上海市化工职业病防治研究所（２０００４１）汤厥铭二异氰酸甲苯酯（ＴＤＩ）对呼吸道粘膜有明显的刺激和致敏作用，乃致呼吸道通气功能障碍。现将本所收治的吸入ＴＤＩ气道致敏六例总结分析如... 详细信息

吸入二异氰酸甲苯酯气道致敏六例临床分析上海市化工职业病防治研究所（２０００４１）汤厥铭二异氰酸甲苯酯（ＴＤＩ）对呼吸道粘膜有明显的刺激和致敏作用，乃致呼吸道通气功能障碍。现将本所收治的吸入ＴＤＩ气道致敏六例总结分析如下：一、ＴＤＩ吸入经过：某厂新建的...

关键词：二异氰酸甲苯酯临床分析甲苯二异氰酸酯支气管激发试验心肌损害中毒心肌炎职业性哮喘呼吸道抗原-抗体复合物特异性变态反应

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影响血小板聚集的物质

国外医学.输血及血液学分册 1986年第2期09卷 65-69页

作者：凌柱三湖南医学院附属第二医院内科

血小板的粘附、聚集与释放等功能对血栓形成与止血具有重要意义,故血小板聚集试验(包括体外及体内聚集)已广泛地被采用于临床诊疗及科研工作。本文对影响血小板聚集的物质,包括聚集诱导剂、聚集抑制剂、释放诱导剂、释放抑制剂等及其作... 详细信息

血小板的粘附、聚集与释放等功能对血栓形成与止血具有重要意义,故血小板聚集试验(包括体外及体内聚集)已广泛地被采用于临床诊疗及科研工作。本文对影响血小板聚集的物质,包括聚集诱导剂、聚集抑制剂、释放诱导剂、释放抑制剂等及其作用机理,加以综述。同一物质常可具有数种作用,如既能诱导聚集,也能诱导释放。有时同一物质由于浓度的不同而出现不同作用。有些相同作用的物质,互相间具有协同作用。不同的物质使血小

关键词：血小板聚集胶原 ADP 凝血酶蛋白酶物质纤维蛋白原球蛋白胰弹性酶抗原-抗体复合物