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作者：邱德奎西北农林科技大学

学位级别：硕士

草鱼出血病(Grass carp hemorrhagic disease,GCHD)是对草鱼威胁最大的病害之一,给草鱼养殖业带来重大经济损失。目前,Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus type Ⅱ,GCRV-Ⅱ)是引起GCHD爆发的最主要病原,疫苗免疫是预防GCHD的重要... 详细信息

草鱼出血病(Grass carp hemorrhagic disease,GCHD)是对草鱼威胁最大的病害之一,给草鱼养殖业带来重大经济损失。目前,Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus type Ⅱ,GCRV-Ⅱ)是引起GCHD爆发的最主要病原,疫苗免疫是预防GCHD的重要方法。其中浸泡免疫方式具有省时省力和便于商业化推广等优点,但是疫苗通过浸泡途径对鱼体进行免疫又有难以突破生物屏障发挥免疫作用的问题。本研究通过基因工程技术对GCRV-Ⅱ VP4蛋白进行抗原表位筛选,以碳纳米管(Single wall carbon nanotube,SWCNTs)为载体、甘露糖(Mannose)为靶向因子构建具有靶向免疫功能的碳纳米管载疫苗系统,评价疫苗的免疫保护效果,并优化免疫程序,确定可产业化的免疫保护方案。主要内容包括以下几个方面:***4蛋白优势抗原表位筛选根据GCRV-Ⅱ代表株的vp4基因序列(1953 bp)将其截短分为4段,分别构建含有p ET32a-vp4、p ET32a-vp4-1、p ET32a-vp4-2、p ET32a-vp4-3和p ET32a-vp4-4(vp4-1片段大小为534 bp,vp4-2、vp4-3和vp4-4片段大小为537 bp)原核表达质粒的基因工程株。通过双酶切和测序验证后导入Escherichia coli BL21(DE3)诱导表达蛋白,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹法检测蛋白表达与活性。最后采用酶联免疫吸附测定法对蛋白进行优势抗原表位筛选,结果显示VP4-3的OD值为1.7609显著高于其它蛋白,可作为预防GCHD候选疫苗抗原。2.靶向性碳纳米管载疫苗系统制备以SWCNTs为载体、Mannose为靶向因子分别构建碳纳米管载亚单位疫苗系统(SWCNTs-VP4和SWCNTs-VP4-3,其中VP4和VP4-3抗原蛋白分别约占52.23%和53.19%),靶向性碳纳米管载亚单位疫苗系统(SWCNTs-M-VP4-3,其中VP4-3抗原蛋白约占45.27%)。通过不同浓度(5、10、20、40和80 mg/L)的靶向性碳纳米管载疫苗系统对草鱼进行浸泡免疫6 h,免疫28 d后,安全性检测结果显示草鱼机体活动正常,死亡率均在10%以下;与对照组相比脂肪酶和淀粉酶的活性、生长性能、肌肉生长发育相关基因表达量(Myf-5、Myo D1和Myo G)均没有显著差异。本章成功构建防治草鱼出血病的靶向性碳纳米管载疫苗系统,80 mg/L以内对草鱼相对安全。3.靶向性碳纳米管载疫苗系统免疫效果研究以VP4(5.0 mg/L)、SWCNTs-VP4(1.0 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L)、SWCNTs-VP4-3(1.0 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L)和SWCNTs-M-VP4-3(1.0 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L)不同疫苗系统对草鱼浸泡免疫6 h,通过测定免疫相关生理指标、血清抗体效价、免疫相关基因表达和相对免疫保护率,评价该疫苗系统的免疫保护效果。结果显示:与其它组相比,SWCNTs-M-VP4-3组的免疫相关基因表达水平、免疫相关生理指标以及血清抗体效价水平均显著升高。病毒攻毒结果显示SWCNTs-M-VP4-3的最高浓度组的免疫保护率最高为60.95%,而SWCNTs-VP4-3、SWCNTs-VP4和VP4组的最高浓度组相对免疫保护率分别为51.43%、42.86%和33.33%。由优势抗原制成的靶向性碳纳米管载疫苗系统通过浸泡免疫可以有效增强草鱼对GCHD的免疫保护效果。4.疫苗应用效果研究通过完全试验对SWCNTs-M-VP4-3疫苗系统的不同免疫参数进行优化,即不同免疫浓度(5、10和20 mg/L)、免疫时间(6、12和24 h)和不同浸泡密度(15、30、60尾/L),采用浸泡方式对草鱼进行免疫,评价疫苗的免疫保护效果。由攻毒试验的结果可知,当免疫时间12 h、免疫浓度10 mg/L为和浸泡密度15尾/L时,免疫保护率最高为88.33%。免疫相关生理指标、血清抗体效价和免疫相关基因表达水平的结果也得出相同的结论。依照上述的免疫方案对某鱼种场的草鱼进行浸泡免疫。病毒攻毒结果表明对照组的平均存活率为11.83%,草鱼处理组的平均存活率为84.67%,相对免疫保护率为82.61%。通过此方案对草鱼进行浸泡免疫,可以显著提高鱼苗的存活率。综上所述,本论文成功筛选GCRV-Ⅱ VP4蛋白优势抗原表位,制备具有靶向功能的碳纳米管载疫苗系统,可实现对草鱼的高效保护,并且通过免疫程序优化确定最合适的免疫方案为疫苗浸泡免疫时间12 h,免疫浓度10 mg/L,浸泡密度30 g/L。在鱼种场进行产业应用取得较好的成果,具有重大实

关键词：草鱼呼肠孤病毒草鱼出血病抗原表位筛选靶向性疫苗系统

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虾源肌球蛋白抗原表位的计算机辅助计算

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吉林大学学报(理学版) 2024年

作者：时月明张哲刘剑兰刘明皓中国医科大学附属第四医院中国医科大学医学人文学院吉林大学生命科学学院

运用在线软件和线下软件对来源于刀额新对虾（Metapenaeus ensis）的过敏原Met e1的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位进行预测与筛选.通过uniprot蛋白数据库获取Met e1蛋白质氨基酸序列，然后用ExPASY ProtParam、SignalP-5.0 Server和TMHM... 详细信息

运用在线软件和线下软件对来源于刀额新对虾（Metapenaeus ensis）的过敏原Met e1的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位进行预测与筛选.通过uniprot蛋白数据库获取Met e1蛋白质氨基酸序列，然后用ExPASY ProtParam、SignalP-5.0 Server和TMHMM Server v. 2.0 在线工具对Met e1的理化性质、信号肽与跨膜区域进行分析.用PSIPRED在线工具、SOPMA在线工具和DNAstar软件联合预测Met e1二级结构，用Swiss model 在线软件预测Met e1三级结构.用DNAStar线下软件和IEDB在线软件综合预测线性B细胞表位，用IEDB在线软件预测CD8+T 细胞表位和CD8+T 细胞表位.最后将所得结果进行B细胞表位和T细胞表位的筛选.结果表明，Met e1蛋白的B细胞表位为7～15，56～61，76～84，151～159，179～183，213～218，223～239，241～246，256～264，266～268位氨基酸，T细胞表位为78～84，223～232位氨基酸.

关键词： Met e1蛋白质 B细胞表位 T细胞表位抗原表位筛选

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DsbC介导HCV优势抗原表位原核可溶性表达与间接ELISA分析

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国际检验医学杂志 2023年第1期44卷 63-68页

作者：肖彭莹黄国红王丽君孙卫国张灵霞侯江厚昆明市妇幼保健院妇女保健部云南昆明650013 解放军总医院第八医学中心结核病研究所北京100091

目的DsbC蛋白与丙型肝炎病毒(HCV)优势抗原表位原核融合表达并纯化,获得一种特异优良的HCV血清抗体诊断抗原。方法通过生物信息学软件,筛选我国HCV主要流行株优势抗原片段并进行串联融合形成组合肽命名为P367,将P367与DsbC蛋白进行融合... 详细信息

目的DsbC蛋白与丙型肝炎病毒(HCV)优势抗原表位原核融合表达并纯化,获得一种特异优良的HCV血清抗体诊断抗原。方法通过生物信息学软件,筛选我国HCV主要流行株优势抗原片段并进行串联融合形成组合肽命名为P367,将P367与DsbC蛋白进行融合后在原核系统内可溶性表达并纯化获得重组抗原DsbC-P367,建立HCV-IgG血清学检测方法,通过对HCV阴阳性血清的检测,评价DsbC-P367与P367在血清学诊断差异,获得一种新型HCV-IgG血清学诊断抗原制作方法。结果通过信息学软件筛选获得的优势抗原表位来源于不同基因型,全长367个氨基酸。通过原核表达系统发现,DsbC-P367以可溶性表达形式存在,亲和纯化后其相对分子质量为63×10^(3),纯度为92%,Western blot实验初步证实重组DsbC-P367与P367蛋白均具有抗原性;对100份明确HCV阴阳性血清进行检测,DsbC-P367与P367灵敏度分别为96%、90%,特异度均为100%,与“金标准”比较,McNemer检验显示均P=1.00,Kappa分别为0.95、0.87,提示DsbC-P367相对于P367具有更优的灵敏度。结论重组获得的DsbC-P367融合肽在HCV血清学抗体检测中具有良好的灵敏度和特异度,可开发为HCV-IgG体外诊断试剂盒用于HCV感染的实验室诊断。

关键词：丙型肝炎病毒抗原表位筛选 DsbC蛋白间接酶联免疫吸附试验

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新型冠状病毒相关TMPRSS2蛋白结构特征和抗原表位分析

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微生物学杂志 2021年第1期41卷 58-68页

作者：戴姿薇唐标湖南中医药大学医学院湖南长沙410208

采用生物信息学方法分析预测新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)跨膜蛋白酶丝氨酸2(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2)的理化特性、结构特征和抗原表位,为抗SARS-CoV-2药物研发提供参考。利用ProtParam、ProtScale分析预测TMPRSS2蛋白酶的理化特性;利用COILS Server、SignalP、TMPred、TargetP Server、NetPhos Server、NetNGlyc Server服务器对TMPRSS2蛋白酶结构进行功能结构的分析预测;利用SOPMA、Pfam、SWISS MODEL分析预测TMPRSS2蛋白酶高级结构;利用IEBD分析预测TMPRSS2蛋白酶B细胞、T细胞表位。TMPRSS2蛋白酶氨基酸组成数为492个,其中丝氨酸占比最高;亲水性较高,含10个跨膜螺旋区;具有4个磷酸化位点,3个糖基化修饰点;二级结构中无规则卷曲占据主导地位,三级结构能与已知的5ce.1.1.A(SMTL ID)模型同源建模;存在13个潜在的B细胞表位,12个得分较高的T细胞表位。

关键词：新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) 跨膜蛋白酶丝氨酸2(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2) 生物信息学序列分析抗原表位筛选

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