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几类具有抗原性的肿瘤免疫模型的研究

几类具有抗原性的肿瘤免疫模型的研究

作者：谢鑫陕西科技大学

学位级别：硕士

癌症的形成机制和治疗一直是医学、生物、数学以及计算机等领域的专家学者关注的重要问题。免疫系统在控制癌症的发展上起着非常重要的作用。近些年来研究并实行的肿瘤免疫疗法,相较于手术、化疗和放疗等传统疗法优点颇多,因此受到了广... 详细信息

癌症的形成机制和治疗一直是医学、生物、数学以及计算机等领域的专家学者关注的重要问题。免疫系统在控制癌症的发展上起着非常重要的作用。近些年来研究并实行的肿瘤免疫疗法,相较于手术、化疗和放疗等传统疗法优点颇多,因此受到了广泛的关注。与此同时许多数学工作者致力于建立适当的模型,以探索肿瘤与免疫系统之间的作用机制,为控制肿瘤乃至癌症的发展提供理论指导。该文在经典肿瘤与免疫系统相互作用模型的基础上,提出了三类具有抗原性的肿瘤与免疫系统相互作用的数学模型,并进行研究。第一个模型是在一些经典肿瘤免疫系统作用模型的基础上引入肿瘤抗原性,并以线性形式来描述肿瘤抗原性。通过分析模型的有界性、平衡点的存在性和全局动力学性态,发现模型会发生鞍结点分支。因此,在一定条件下,模型的有瘤平衡点和无瘤平衡点会同时稳定,这表明肿瘤最终的发展趋势会依赖于其初始状态。同时通过判断局部稳定的正平衡点（有瘤平衡点）的类型,得到了肿瘤后期发展阶段的可能变化特征。第二个模型在第一个模型的基础上,考虑从肿瘤形成到刺激效应细胞产生需要一定时间这一事实,引入抗原作用时滞,分析结果显示该时滞仅影响有瘤平衡点的稳定性,能使得模型经过Hopf分支产生稳定的周期解。应用时滞微分方程的分支理论,判断了模型发生Hopf分支的条件以及Hopf分支性质。并通过数值模拟展示了时滞对模型动力学行为的影响。第三个模型是将第一个模型中效应细胞对肿瘤细胞的抑制作用项由线性形式改进为具有饱和性质的Michaelis-Menten函数形式而得到。以多种形式讨论了该模型有瘤平衡点的存在性,得到了平衡点的局部稳定性和非常数周期解不存在的充分条件。应用分支理论给出了判断Hopf分支类型的Lyapunov常数和产生B-T分支的条件,理论分析了效应细胞在肿瘤部位常数输入率对肿瘤发展的影响,并通过数值模拟显示了肿瘤抗原性的改变会使模型出现鞍结点分支和同宿轨分支等复杂的动力学性态。对三个模型的分析表明,肿瘤的抗原性会影响模型平衡点的个数以及分支和周期解的稳定性等动力学性态。这意味着肿瘤抗原性的强弱会影响肿瘤的发展是会趋于休眠还是进入免疫逃逸状态。因此,研究肿瘤抗原性的作用对控制肿瘤的发展有着重要的现实意义。

关键词：肿瘤免疫模型稳定性 Hopf分支抗原性时滞

不同产地品种的花生蛋白质抗原性差异及其结构特征研究

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粮食与油脂 2023年第4期36卷 145-149,159页

作者：任红涛李静余秋颖李军伟王凡王娜河南农业大学河南郑州450002 农业农村部大宗粮食加工重点试验室河南郑州450002 国际动物免疫学联合研究中心河南郑州450002

通过检测不同产地及品种花生蛋白质的抗原性,并分析其蛋白质结构特性。结果表明:“豫南阳鲁花8号”的抗原性最高,为2.270,"鲁济南四粒红"的抗原性最低,为0.804;花生蛋白质抗原性与二级结构中β-折叠呈极显著负相关,相关系数为-0.752(P<0... 详细信息

通过检测不同产地及品种花生蛋白质的抗原性,并分析其蛋白质结构特性。结果表明:“豫南阳鲁花8号”的抗原性最高,为2.270,"鲁济南四粒红"的抗原性最低,为0.804;花生蛋白质抗原性与二级结构中β-折叠呈极显著负相关,相关系数为-0.752(P<0.01),与β-转角呈极显著正相关,相关系数为0.750(P<0.01),与α-螺旋和粒径呈显著负相关,相关系数分别为-0.466、-0.482(P<0.05)。

关键词：花生蛋白质抗原性结构特性

血凝素糖基化模式对G57基因型H9N2亚型禽流感病毒抗原性的影响

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中国兽医学报 2023年第8期43卷 1612-1617页

作者：孙艺学于海英张鹏举丛彦龙长春大学吉林省生物医学工程研发中心吉林长春130022 吉林大学动物医学学院吉林长春130062 吉林省农业科学院动物生物技术研究所

G57基因型H9N2亚型流感病毒是当前威胁我国养禽业健康发展的重要病原。该病毒的免疫逃逸机制是值得探究的科学问题。本研究利用反向遗传技术拯救了5株具有不同血凝素(hemagglutinin,HA)糖基化模式的病毒。基于交叉血凝抑制结果绘制的抗... 详细信息

G57基因型H9N2亚型流感病毒是当前威胁我国养禽业健康发展的重要病原。该病毒的免疫逃逸机制是值得探究的科学问题。本研究利用反向遗传技术拯救了5株具有不同血凝素(hemagglutinin,HA)糖基化模式的病毒。基于交叉血凝抑制结果绘制的抗原图谱显示,这5株病毒存在明显的抗原差异。这种差异与HA上的第21,210,289,304位糖基化位点直接相关,其对病毒抗原性的影响由大到小依次为304,210,289,21位糖基化位点。结果表明,HA糖链可能影响其周围的抗原表位的暴露程度,进而影响抗体与HA的结合,致使具有不同HA糖基化模式的病毒表现出抗原差异。因此,加强对流感病毒位点特异性糖基化的认识,从而更加准确地辨析HA糖基化与抗原距离的关系,对预测特定毒株的免疫逃逸能力以及疫苗的设计提供了依据。

关键词：禽流感 H9N2亚型 G57基因型血凝素糖基化抗原性

DAS-ELISA检测花生致敏原Ara h 3抗原性变化方法的建立

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DAS-ELISA检测花生致敏原Ara h 3抗原性变化方法的建立

作者：吴枭河南工业大学

学位级别：硕士

花生作为生活中常见的食物,含有大量的脂肪和蛋白质,花生蛋白作为一种质量好、具有价格优势的植物蛋白,无论是添加到动物性还是植物性食材原料中,都能改善品质、强化营养。然而作为八大类致敏性食物之一的花生,其中主要的致敏原蛋白Ara ... 详细信息

花生作为生活中常见的食物,含有大量的脂肪和蛋白质,花生蛋白作为一种质量好、具有价格优势的植物蛋白,无论是添加到动物性还是植物性食材原料中,都能改善品质、强化营养。然而作为八大类致敏性食物之一的花生,其中主要的致敏原蛋白Ara h 3结构稳定,与豆科蛋白具有较高的相似度,会对过敏患者的身体健康造成影响。本研究通过探究湿热处理对Ara h 3抗原性与蛋白结构的影响,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定(Doubie-antibidy-sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay,DAS-ELISA)检测方法,检测花生湿热处理类食物的抗原性变化,正确指导含Ara h 3湿热处理类食物的生产,从而开发具有低致敏性或完全不具有致敏性的含Ara h 3制品,对花生过敏人群具有重大意义。本试验主要工作方法:首先,采用硫酸铵分级沉淀的方法从脱脂花生粉中提取并纯化Ara h 3,研究湿热处理对Ara h 3抗原性和蛋白结构的影响,并确定降低其抗原性的最优湿热处理条件;其次,用体外模拟消化试验评价Ara h 3在湿热处理后的消化稳定性变化;最后,建立针对Ara h 3的双抗体夹心ELISA检测方法,探讨含有Ara h 3的食物经湿热处理后抗原性变化。研究结果如下:采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)试验鉴定Ara h 3的纯度,电泳结果显示,提取出的Ara h 3经过纯化后具有较高的纯度。采用Band Scan分析软件对提取得到的Ara h 3电泳条带灰度值进行计算,结果表明Ara h 3的纯度在75%以上,满足试验所需的要求。湿热处理对Ara h 3抗原性的影响:通过间接ELISA法测定湿热处理对Ara h 3抗原性的影响,结果显示Ara h 3的最优湿热处理条件为:湿热处理温度为90℃,时间为30 min。湿热处理对Ara h 3结构特性的影响:还原型电泳结果分析显示,在经过100℃、30 min的湿热处理后Ara h 3发生解聚,生成较小分子质量的蛋白条带,并出现不可溶的大分子质量的蛋白聚集体。用荧光光谱技术对Ara h 3的外源荧光进行检测,结果表明,在湿热处理温度为90℃,时间为20 min时,荧光强度增加,Ara h 3的三级结构发生变化;紫外可见光谱检测结果显示湿热处理温度在80～90℃,时间为20～30 min条件下,游离巯基含量提高;圆二色光谱测定湿热处理后Ara h 3的二级结构变化,研究发现,经过90℃湿热处理后,β-折叠和α-螺旋的比例降低,无规则卷曲的比例增加;经过体外模拟消化后,未处理的Ara h 3条带被逐渐消化为小分子物质,抗原性降低,相比于未处理的Ara h 3,湿热处理后的蛋白条带被进一步消化成分子量更小的蛋白条带甚至完全消化成游离的氨基酸,抗原性降至更低。建立针对Ara h 3的双抗体夹心ELISA检测方法,将最优湿热处理条件的Ara h 3与抗Ara h 3兔源多克隆抗体混合后温育,制备出湿热处理破坏Ara h 3抗原表位特异性抗体作为包被抗体,使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗Ara h 3兔源多克隆抗体作为检测抗体,对含Ara h 3的食物经湿热处理后的抗原性变化进行分析:特异性测定结果表明,本方法具有较为良好的特异性,其临界值为0.2431,超过临界值即为阳性。通过敏感性分析,获得的检测限为39.06 ng/m L。本方法的板内变异系数低于3.05%,板间变异系数低于6.79%。添加回收试验显示Ara h 3的添加回收率在78.48%～90.93%之间。对含有Ara h 3的湿热处理类食物使用建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测,结果显示,花生湿热处理类食物花生酱、花生奶酪、花生牛奶和水煮花生的OD值低于脱脂花生粉的OD值。结果说明,上述几类含有Ara h 3的食物经过湿热处理,蛋白质抗原性降低。可能是在湿热处理的过程中,食物中Ara h 3所含有的部分抗原表位遭到破坏或者包埋,降低了与湿热处理破坏Ara h 3抗原表位的特异性抗体结合的能力,导致OD检测值降低。而脱脂花生粉中的Ara h 3并未遭到破坏或者包埋,致敏原蛋白能够与抗体发生特异性结合,因此OD检测值高。这种方法可以用来检测含Ara h 3食物在经过湿热处理后的抗原性发生的变化,从而可以更好地指导含Ara h 3湿热处理类食物的安全生产,进而降低其对Ara h 3致敏患者的影响。

关键词： Ara h3 湿热处理抗原性蛋白结构体外模拟消化双抗体夹心ELISA

IBDV新型变异株与超强毒株致病性和抗原性差异及其分子机制研究

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IBDV新型变异株与超强毒株致病性和抗原性差异及其分子机制研究

作者：姜楠中国农业科学院

学位级别：硕士

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的主要危害雏鸡的一种急性、高度接触性、免疫抑制性传染病。19世纪80年代末,以急性死亡为特征的IBDV超强毒株... 详细信息

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的主要危害雏鸡的一种急性、高度接触性、免疫抑制性传染病。19世纪80年代末,以急性死亡为特征的IBDV超强毒株（Very virulent IBDV,vvIBDV）给世界养禽业造成了巨大的损失,随着集约化管理水平的提高和疫苗的普及,vvIBDV正在逐渐得到控制。而近年来IBDV新型变异株（Novel variant IBDV,nVarIBDV）在我国突然出现并广泛流行,虽不直接致死鸡,但可引起鸡群严重的免疫抑制,给养禽业带来了新的威胁。为了进一步监测IBDV的流行情况,本研究于2019～2020年在我国主要养禽地区开展了IBDV分子流行病学研究。基于VP2的高变区（Hypervariable region,HVR）和VP1的B-Marker核苷酸序列的遗传演化分析结果显示,检测样品中新型变异株（A2d B1基因型）、HLJ0504样超强毒株（A3B3基因型）、经典株（A1B1基因型）、弱毒株（A8B1基因型）、A2d B3型节段重配毒株、A3B1型节段重配毒株的占比分别为52%、30%、2%、2%、8%、6%。这说明,我国IBDV呈多种毒株共存的流行特征,新近出现的nVarIBDV和持续流行的vvIBDV是目前两大重要流行毒株。两大流行毒株（nVarIBDV和vvIBDV）的致病性和抗原性存在明显差异,但其分子机制尚不清楚。vvIBDV可以致死鸡,但nVarIBDV不致死鸡。本研究首先研究了两大流行毒株致死性差异的分子机制。以vvIBDV代表毒株HLJ0504为亲本骨架替换nVarIBDV代表毒株SHG19的VP2高变区的Loop区,成功拯救出替换P、P、P Loop区的3株重组病毒。致病性试验显示,3个Loop区的替换均能够显著影响r HLJ0504的致病性,其中P Loop区替换的影响最大。针对P Loop区的第279位氨基酸向nVarIBDV方向进行了点突变病毒的构建及拯救,致病性试验显示,D279N突变可将r HLJ0504的致死率由70%降低为0%。进一步研究发现,D279N突变可降低淋巴器官和血液中的病毒载量及病毒感染诱导的炎症因子水平。这些数据证明,VP2蛋白的279位氨基酸是两大流行毒株（nVarIBDV和vvIBDV）致死性差异的关键分子基础。本研究进一步探索了两大流行毒株（nVarIBDV和vvIBDV）抗原性差异的原因。抗原性相关实验结果显示,P、P、P 3个Loop区均能影响病毒的抗原性;P Loop区的D279N突变能够显著降低vvIBDV单因子抗血清对突变病毒的中和作用;同时,N279D突变能够显著地降低nVarIBDV单因子抗血清对突变病毒的中和作用。进一步研究发现,D279N可影响抗体与抗原的亲和力。这些数据证明,VP2蛋白的279位氨基酸是两大流行毒株（nVarIBDV和vvIBDV）的抗原性差异的重要分子基础之一。本研究明确了自nVarIBDV出现以来我国IBDV的流行新特点,即多种毒株共存,新近出现的nVarIBDV和持续流行的vvIBDV是当前两大重要流行毒株;证明了VP2蛋白的279位氨基酸是影响两大流行毒株（nVarIBDV和vvIBDV）的致病性和抗原性差异的重要分子基础,并初步揭示了其分子机制。本研究结果对抗原匹配疫苗的研制以及IBD的综合防控提供了科学依据。

关键词：传染性法氏囊病病毒新型变异株超强毒株致病性抗原性

超高压联合热加工对大豆球蛋白抗原性的影响及A2破坏表位的定位

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超高压联合热加工对大豆球蛋白抗原性的影响及A2破坏表位的定位

作者：李英英河南工业大学

学位级别：硕士

大豆植物蛋白具有很高的营养价值,已被广泛用于食品工业中,例如制作面食、烘焙食品、儿童食品、保健食品等。然而,大豆也被列为联合国粮农组织认可的十四种主要食物过敏原之一,大量研究证明,加工可以显著降低大豆中过敏原蛋白的抗原性,... 详细信息

大豆植物蛋白具有很高的营养价值,已被广泛用于食品工业中,例如制作面食、烘焙食品、儿童食品、保健食品等。然而,大豆也被列为联合国粮农组织认可的十四种主要食物过敏原之一,大量研究证明,加工可以显著降低大豆中过敏原蛋白的抗原性,精确定位到加工破坏的抗原表位,对大豆过敏人群具有重大意义。本文选用碱溶酸沉的方法从脱脂豆粉中提取大豆球蛋白,将提取的大豆球蛋白经过超高压联合热加工处理,研究加工对大豆球蛋白抗原性和结构性的影响。采用SDS-PAGE、外源荧光、游离巯基和傅立叶红外等方法检测加工对大豆球蛋白结构的影响,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹检测加工对大豆球蛋白抗原性的影响,用体外模拟消化实验评估加工后大豆球蛋白的消化稳定性。结果显示,与未加工的样品相比,加工后的大豆球蛋白二硫键断裂,分子量发生变化,随着温度的逐渐升高,酸性肽链条带逐渐变浅直至消失;蛋白样品中的疏水基团、游离巯基、α-螺旋、β-转角和无规卷曲的含量增加,β-折叠含量减少。当温度到达130°C时,蛋白质抗原的抑制率达到37%,比未处理的蛋白质抗原降低50%,抗原抑制率达到最低。经过体外模拟消化评估,加工可以显著降低大豆球蛋白的抗原性。通过NCBI数据库检索A2肽链的氨基酸序列,结合生物信息学对其重叠分段,将A2肽链相邻片段重叠约135个碱基,将其分为A2-1,A2-2,A2-3三个片段,使用pr imer 5软件设计引物,将A2全长及其重叠分段PCR扩增后的基因胶回收,与T载体相连构建克隆载体转化到大肠杆菌,将转化成功的阳性菌扩大培养提取质粒,酶切后与T7噬菌体载体臂相连,体外包装后侵染大肠杆菌,得到阳性重组噬菌体,扩大培养后得到A2肽链及其重叠分段基因的噬菌体蛋白。在破坏抗原最强的加工条件下,将过量的热加工和联合处理的大豆球蛋白与多抗血清充分混合吸收,得到两种加工破坏抗原表位的特异性抗体。将加工破坏的多抗血清与噬菌体蛋白反应,初步定位加工破坏表位的优势抗原区域为A2-3片段,该片段的氨基酸序列为SGFAPEFLKEAFGVNM QIVRNLQGENEEEDSGAIVTVKGGLRVTAPAMRKPQQEEDDDDEEEQPQCVETDKG CQRQSK。将A2-3片段重叠15个碱基将其分为A2-3-A、A2-3-B、A2-3-C三个片段,再次筛选加工破坏的抗原优势区域,最终精确定位到加工破坏的抗原优势区域为A2-3-B片段,该片段的氨基酸序列为AIVTVKGGLRVTAPAMRKPQQEEDDDDEE EQPQCVE。通过在线分析软件预测A2-3-B片段的二级结构,该片段中含有11.11%的α-螺旋、25%的β-折叠和63.89%的无规卷曲,将A2-3-B相互重叠约18个碱基分为3个肽段,由Dot-Blot和ELISA检测结果可知,多抗血清和肽3反应但和肽1、肽2不反应,说明在肽1和肽2中不含与大豆球蛋白多抗血清结合的线性抗原位点,肽3中含有抗原线性表位,两种加工破坏的抗体与3条肽都不反应,说明加工并未破坏与三条肽结合的线性表位,通过噬菌体表达出A2-3-B片段能与加工破坏的特异性抗体反应,说明在该片段中含有加工破坏的构象表位,而对应的线性抗原表位未被破坏。与过敏患者血清反应,发现肽3具有致敏性,肽3片段的氨基酸序列为QEEDDDDEEEQPQCVE,采取丙氨酸替代技术对肽3定点突变,经过Dot-Blot和ELISA检测显示,当第2(D),3(E),4(E),6(Q),9(C)位的氨基酸突变后,突变后的肽段不与大豆球蛋白多抗血清发生特异性结合,D,E,E,Q和C可能是显著影响肽3抗原性的关键氨基酸。

关键词：超高压联合热加工抗原性重叠分段噬菌体展示重叠多肽

牛乳腺炎粪肠球菌溶血素CylA基因突变株的构建及溶血素抗原性研究

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牛乳腺炎粪肠球菌溶血素CylA基因突变株的构建及溶血素抗原性研究

作者：邢家辉内蒙古民族大学

学位级别：硕士

本实验为了构建牛乳腺炎粪肠球菌溶血素CylA基因突变株及探索溶血素抗原性,以Genbank上公布的粪肠球菌CylA基因序列为模板（序列号为AY032999.1）,分别设计上、下游同源臂序列扩增引物。经过PCR获得CylA基因上游同源臂序列X及CylA基因... 详细信息

本实验为了构建牛乳腺炎粪肠球菌溶血素CylA基因突变株及探索溶血素抗原性,以Genbank上公布的粪肠球菌CylA基因序列为模板（序列号为AY032999.1）,分别设计上、下游同源臂序列扩增引物。经过PCR获得CylA基因上游同源臂序列X及CylA基因下游同源臂序列Y,将CylA基因中间序列替换为p ACYC184质粒中的氯霉素抗性基因Chl,降低实验菌株对氯霉素的敏感程度以便使用抗生素抗性筛选。将X、Chl及Y序列依次连接并转入温敏型自杀质粒p SET4S中,构建粪肠球菌CylA基因缺失重组质粒p SET4S-X-Chl-Y。将该重组质粒电转至粪肠球菌溶血阳性菌株,经过多次细菌传代,通过抗生素抗性筛选出粪肠球菌溶血素CylA基因突变株。同时克隆粪肠球菌溶血素CylA基因进行原核表达,探索其免疫原性。经PCR及单双酶切鉴定结果显示,CylA基因缺失重组质粒成功构建。经PCR及溶血表型鉴定,结果表明成功获得粪肠球菌溶血素CylA基因突变株,为粪肠球菌CylA基因对于溶血素的致病机制及免疫机制研究奠定了研究基础。CylA基因克隆、测序结果显示,成功克隆出1 239 bp的目的DNA条带。构建的p ET-30a-CylA重组质粒使用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳鉴定,结果显示表达的编码蛋白相对分子质量为37 k D,经镍耦合亲和层析柱纯化后获得的蛋白含量为1.5 mg/m L。利用该表达抗原与弗氏佐剂乳化,免疫家兔后经ELISA抗体滴度检测,结果显示在首免以后的第28 d抗滴度达到1:5 000,显示了其抗原性,为进一步研发奶牛乳腺炎基因工程疫苗提供了候选亚单位抗原。

关键词：奶牛乳腺炎粪肠球菌 CylA基因突变抗原性

2020-2021年我国部分地区H9N2亚型禽流感流行病学调查及其抗原性分析

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2020-2021年我国部分地区H9N2亚型禽流感流行病学调查及其抗原性...

作者：李茵婧南京农业大学

学位级别：硕士

H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）于1966年首次在美国威斯康星州火鸡体内分离,1994年在我国广东地区首次出现,随后在我国的流行范围逐渐扩大,是我国目前流行范围最广的低致病性禽流感病毒。H9N2亚型AIV不仅可以在禽类... 详细信息

H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）于1966年首次在美国威斯康星州火鸡体内分离,1994年在我国广东地区首次出现,随后在我国的流行范围逐渐扩大,是我国目前流行范围最广的低致病性禽流感病毒。H9N2亚型AIV不仅可以在禽类种内传播,还能跨越物种屏障感染哺乳动物和人类。H9N2亚型AIV病毒还可以通过基因重组为其它高致病性禽流感,如H5N1和H7N9病毒提供部分或者全部的内部基因,目前H9N2亚型禽流感严重影响我国家禽业的经济发展且威胁着人畜公共卫生安全。由于禽流感病毒的RNA聚合酶缺乏校正机制,因此病毒的核苷酸在不断突变,突变累积后会产生抗原变异,随着病毒的变异,疫苗的保护效果会显著降低,甚至出现疫苗免疫鸡发病和死亡的现象。尽管病毒在不断变异和进化,疫苗也在不断更新,但是仍然存在疫苗毒株更新速度赶不上病毒变异速度的情况,导致疫苗对于新的流行株不能起到良好的免疫保护作用,从而引起免疫失败和疫病流行。为了减少或避免免疫失败,需要对禽流感进行严密的监测,及时评估疫苗株对流行毒株的保护效果,更新或增加疫苗株种毒信息。因此,了解我国H9N2亚型禽流感的流行状况、进化特征、抗原变异特征以及疫苗保护效果极其紧迫且意义重大。1.2020-2021年我国部分地区H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及抗体水平检测本研究采集2020年4月～2021年12月江苏某养殖公司、分公司及潍坊、洛阳、阜阳、常州及广州的部分地区养殖户的鸡群及出栏商品鸡群喉咽拭子及具有呼吸道症状的病死鸡的肺组织样品共计513份。样品通过接种鸡胚,收取尿囊液并进行RT-PCR检测,发现H9亚型禽流感阳性率为5.84%,共分离到H9N2亚型禽流感病毒20株,H9N2病毒的分离率为3.90%。本研究在安徽省某市和河南省某市内数十家活禽交易市场及养殖户采集不同日龄、不同品种肉鸡血清样本559份。通过血凝抑制试验检测血清样品中H5、H7、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒的抗体水平。结果表明活禽交易市场内出栏商品鸡血清抗体水平较高,说明免疫程序合理,抗体水平可稳定维持至出栏,散养户使用的免疫程序能够使机体对于禽流感和新城疫产生稳定的血清抗体,但是部分散养户的鸡只的抗体水平不高,这可能与散养户在执行疫苗免疫时使用不当、禽类自身的遗传因素和养殖环境有关。然而,我们在H9亚型禽流感免疫程序完整且H9亚型禽流感的抗体水平达到7log以上的鸡只中仍然分离到H9N2禽流感病毒,说明H9N2病毒发生了免疫逃避而不受当前疫苗株的保护。2.H9N2亚型禽流感病毒遗传进化分析及抗原性分析通过对分离到的20株H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因进行测序,使用DNAstar软件和MEGA X生物学软件拼接和比对基因序列、绘制基因遗传进化树,发现其HA和NA基因均属于欧亚谱系,HA基因遗传进化树显示所有20株病毒均属于h9.***.2.5分支,但是分离株位于不同的小进化分支上,与当前疫苗株的HA基因存在一定序列差异且处于不同分支,说明当前的部分H9N2亚型禽流感分离株发生了变异。通过对HA基因关键氨基酸位点分析发现,HA裂解位点均为PSRSSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征,HA基因的受体结合位点在216位（H9编码）均为L,具有结合哺乳动物受体的能力。分离株在HA基因在200～202位缺失一个潜在糖基化位点,第295～297位新增一个潜在糖基化位点,推测可能会影响病毒的感染能力和复制效率。NA基因进化树显示20株分离株均属于Y280-like分支。NA基因在颈部均缺失3个氨基酸,红细胞结合位点有部分氨基酸发生突变,可能会影响病毒与唾液酸结合的能力,NA的潜在糖基化位点均包含69～71、86～88、146～148、200～202以及234～236位点。个别毒株在HA 148～150位增加了一个潜在糖基化位点,个别毒株在NA44～46位增加一个潜在糖基化位点而在368～370位丧失潜在糖基化位点,部分毒株在NA 402～404位有潜在糖基化位点,这些位点糖基化的功能有待进一步研究。通过交叉血凝抑制试验分析15株分离株和6株疫苗毒株的抗原性差异,交叉血凝抑制试验结果表明,分离株与疫苗株的抗原性差异显著,在同一个地区分离毒株间亦存在抗原性差异,推测同一地区的分离株发生了不同形式的抗原变异,序列分析发现分离株HA基因的关键抗原位点发生突变,推测可能是由于这些位点的突变引起当前H9N2流行毒株发生抗原变异导致疫苗免疫保护率下降,但是这些位于抗原决定区的氨基酸变异对于病毒抗原性有何影响还有待进一步研究。综上所述,本研究的开展为禽流感的防控和疫苗毒株的筛选提供了实验依据。

关键词：禽流感 H9N2亚型流行病学调查遗传进化抗原性

烟曲霉Hsp70和HscA的抗原性、免疫原性及其潜在临床意义研究

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烟曲霉Hsp70和HscA的抗原性、免疫原性及其潜在临床意义研究

作者：鲁凡博安徽医科大学

学位级别：硕士

研究背景:曲霉菌属是种广泛存在于自然环境中的机会性致病真菌,主要通过吸入的方式感染机体,由曲霉菌引起的侵袭性肺炎和血行播散性感染,称之为侵袭性肺曲霉病(Invasive pulmonary aspergillosis,IPA)或侵袭性曲霉病(Invasive aspergill... 详细信息

研究背景:曲霉菌属是种广泛存在于自然环境中的机会性致病真菌,主要通过吸入的方式感染机体,由曲霉菌引起的侵袭性肺炎和血行播散性感染,称之为侵袭性肺曲霉病(Invasive pulmonary aspergillosis,IPA)或侵袭性曲霉病(Invasive aspergillosis,IA),其中烟曲霉是临床最为常见的曲霉菌。IA是最致命的曲霉病,尽管真菌感染的治疗及护理手段已经取得了不小的进步,但IA死亡率仍居高不下。IA的高感染率和死亡率,决定了其早期诊断以及及时治疗的重要意义与价值,由于烟曲霉感染没有较为特异的临床特征,细菌/真菌培养需要一定周期,因此IA的早期诊断较为棘手,易被误诊。有研究显示,IA的误诊率可高达73%。近年有研究指出烟曲霉Hsp70和Hsc A分布于菌体表面并有可能具有诱导保护性免疫反应或介导免疫逃避的抗原表位,故此本研究对Hsp70和Hsc A的抗原性及免疫原性分别进行评估以探究其作为烟曲霉血清学检测候选抗原或疫苗靶点的潜力。方法:此次研究通过构建重组Hsp70和Hsc A质粒并利用原核表达载体表达重组蛋白,然后利用镍离子凝胶亲和柱进行蛋白纯化,注射纯化后的Hsp70和Hsc A于实验动物进行免疫。然后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测临床烟曲霉感染的患者以及Hsp70/Hsc A免疫后小鼠的血清/血浆中特异Ig G抗体及其Ig G亚型水平。此外,本研究利用体外试验,进一步探究经Hsp70/Hsc A免疫后小鼠脾细胞的抗原特异性免疫应答和Th1/Th2/Th17型细胞因子分泌模式。最后,利用流式细胞术探究经Hsp70/Hsc A免疫后小鼠外周血/脾脏的淋巴细胞亚群分类特征等。结果:成功表达重组蛋白并免疫小鼠,经Hsp70或Hsc A免疫后小鼠外周血中皆存在识别烟曲霉菌体蛋白Ig G型抗体。另外,临床烟曲霉感染患者的Hsp70特异性Ig G水平高于未感染对照组(Hsp70 AUC=0.8400,cut-off值>1.089,敏感度为76.00%,特异度为86.67%)。Hsp70免疫后小鼠的血浆中存在Hsp70特异性Ig G抗体,Ig G亚型分析显示Ig G1是其主要型别。Th1型、Th2型和Th17型的细胞因子均有分泌。Hsp70免疫后小鼠外周血/脾脏的B淋巴细胞百分比均低于对照组,而脾脏T淋巴细胞百分比高于对照组。同样地,烟曲霉感染患者中Hsc A特异性Ig G水平显著地高于未感染的对照患者(Hsc A AUC=0.9867,cut-off值>1.008,敏感度为96.00%,特异度为100.00%)。经过Hsc A蛋白免疫后的小鼠宿主外周血中亦可检测到可观的针对Hsc A蛋白特异性Ig G抗体,其Ig G亚型也主要表现为Ig G1型。该免疫小鼠体内亦存在Th1型、Th2型和Th17型的细胞因子分泌。经Hsc A免疫后该类小鼠外周血/脾脏的主要淋巴细胞亚群分类比例同对照组无显著性差异。结论:研究结果显示本研究中临床烟曲霉感染患者体内明确地存在针对烟曲霉Hsp70与Hsc A的抗体;通过检测外周血烟曲霉Hsp70和/或Hsc A抗体水平,在辅助判断宿主是否存在烟曲霉感染方面,具有较高的敏感度和特异度且Hsc A优于Hsp70;实验结果显示此两种蛋白皆具有良好的抗原性及免疫原性,都可诱导Th1/Th2/Th17型细胞因子分泌和更好的细胞及体液免疫应答,包括高水平Ig G1抗体的产生;提示Hsp70/Hsc A具有成为诊断烟曲霉感染候选抗原及疫苗靶点的潜在价值。

关键词：抗原性免疫原性烟曲霉 Hsp70 HscA