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基于实验设计的抗PD-1/PD-L1单抗报告基因抗体依赖细胞介导的细胞毒效应生物学活性优化及验证方法的建立

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中国药学杂志 2019年第24期54卷 2010-2017页

作者：刘春雨于传飞崔永霏肖启东黄璟王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定方法及标准化重点实验室

目的利用实验设计(design of experiment,DOE)建立抗程序性死亡因子1(programmed cell death 1,PD-1)及其配体(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)单抗基于报告基因的抗体依赖细胞介导的细胞毒效应(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性优化及验证方法。方法利用Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,分别以293FT-PD-1细胞系和CHO-PD-L1细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(Bright GloTM Luciferase Assay system)建立抗PD-1/PD-L1单抗的ADCC生物学活性检测方法,并运用DOE方法进行试验优化和方法学验证。结果抗PD-1/PD-L1单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D,方法经优化后确定抗体量效范围分别为10 000~4. 833 ng·m L^-1和2 000~0. 488 ng·m L^-1,效靶比(effect target ratio,E∶T)为分别为6∶1和3∶1,诱导时间均为20 h。该方法具有良好的专属性;抗PD-1单抗4个不同稀释组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(51. 74±2. 22)%、(77. 12±3. 14)%、(118. 71±2. 83)%和(156. 20±12. 99)%;对应的回收率分别为(103. 49±4. 44)%、(102. 83±4. 19)%、(94. 96±2. 26)%和(104. 14±8. 66)%,抗PD-L1单抗4个不同稀释组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(54. 32±4. 75)%、(75. 24±4. 25)%、(127. 40±2. 43)%和(156. 82±3. 27)%;对应的回收率分别为(108. 64±9. 51)%、(100. 33±5. 67)%、(101. 92±1. 94)%和(104. 55±2. 18)%,上述结果的RSD均小于10%。结论本实验利用DOE设计成功建立基于报告基因的抗PD-1/PD-L1单抗ADCC生物学活性的优化及验证方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗PD-1/PD-L1单抗ADCC生物学活性的评价方法。

关键词：实验设计抗PD-1/PD-L1单抗单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用生物学活性报告基因优化验证

靶向人Claudin18.2单克隆抗体的制备与鉴定

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中国新药杂志 2022年第21期31卷 2120-2127页

作者：张坤明梁红远曹趁心吴丽娜于瑶陆瑾邱建华瞿爱东上海生物制品研究所有限责任公司上海200051

目的:制备特异性结合人紧密连接蛋白18.2(Claudins18.2,CLDN18.2)单克隆抗体。方法:采用编码人CLDN18.2的质粒DNA和高表达人CLDN18.2重组细胞系免疫小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体,并对其进行活性鉴定。通过Cell-based ELIS... 详细信息

目的:制备特异性结合人紧密连接蛋白18.2(Claudins18.2,CLDN18.2)单克隆抗体。方法:采用编码人CLDN18.2的质粒DNA和高表达人CLDN18.2重组细胞系免疫小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体,并对其进行活性鉴定。通过Cell-based ELISA方法进行杂交瘤筛选获得特异性抗体,并构建嵌合抗体对其与高表达重组细胞系和低表达CLDN18.2的NUGC4细胞结合活性进行评价;采用报告基因法对嵌合抗体的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)活性进行检测;采用CCK8法对嵌合抗体的补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity, CDC)活性和增殖抑制活性进行检测。结果:共筛选出4株特异性结合人CLDN18.2的杂交瘤细胞株,分别命名为mab429,mab623,mab624,mab782,并对其进行亚型测定;成功获得4株抗体可变区序列,并构建嵌合抗体;嵌合抗体均与人CLDN18.2特异性结合,其中嵌合抗体ch782与NUGC4细胞结合活性优于参照抗体。ch782能诱导对靶细胞的ADCC活性和CDC活性,且ch782对NUGC4细胞的ADCC活性强于参照抗体;ch782对靶细胞的增殖抑制效果优于参照抗体,并且具有一定的剂量依赖效应。结论:制备了高亲和力特异性结合CLDN18.2的单克隆抗体,并对其结合活性、ADCC活性、CDC活性、增殖抑制活性进行了评估。

关键词： CLDN18.2 胃癌单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用

基于报告基因的抗HER2单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法的建立及应用

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药物分析杂志 2019年第1期39卷 51-61页

作者：刘春雨王馨于传飞徐刚领王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定方法及标准化重点实验室北京102629 福建省医疗器械与药品包装材料检验所福州350001

目的:利用转基因细胞法建立抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单抗的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法:利用Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,SKBR3细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(BioGloTM Luciferase Assay system)进行抗HER2单抗的ADCC生物学活性检测,同时对试验条件进行优化及方法学验证,并将该检测方法用于不同类型的抗HER2单抗ADCC效应的评价。结果:抗HER2单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(x/C)~B]+D,方法经优化后确定靶细胞为SKBR3细胞,抗体稀释起始工作质量浓度为4 000 ng·mL^(-1),1∶4倍的稀释倍数,效靶比为15∶1,诱导时间为20 h。该方法具有良好的专属性;3次独立检测的板间、日间最大诱导倍数(fold of induction,FI)及半数有效浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)的RSD均小于10%; 4个不同稀释组回收率样本经3次测定,相对效价分别为(46.27±2.01)%、(71.18±1.55)%、(133.17±9.91)%以及(166.55±15.73)%;对应的回收率分别为(92.53±4.01)%、(94.91±2.07)%、(106.54±7.93)%、(111.04±10.48),RSD均小于10%,且该方法也适用于不同变性程度及各类抗HER2单抗的ADCC效应评价。结论:本研究利用转基因细胞法成功建立抗HER2单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗HER2单抗ADCC生物学活性的常规检测方法。

关键词：抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用生物学活性荧光素酶检测系统报告基因

抗H7N9禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

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抗H7N9禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

作者：杨帆浙江大学

学位级别：硕士

2013年,我国首次报道新型H7N9禽流感病毒(H7N9病毒)感染人类,并造成大量死亡病例。抗H7N9病毒药物有限,对其开展快速检测和抗病毒药物研究迫在眉睫,本文开展以下三部分研究:第一部分,抗H7N9病毒血凝素(HA)蛋白单克隆抗体(单抗)制备。以H... 详细信息

2013年,我国首次报道新型H7N9禽流感病毒(H7N9病毒)感染人类,并造成大量死亡病例。抗H7N9病毒药物有限,对其开展快速检测和抗病毒药物研究迫在眉睫,本文开展以下三部分研究:第一部分,抗H7N9病毒血凝素(HA)蛋白单克隆抗体(单抗)制备。以H7N9病毒疫苗(A/ZJU01/PR8/2013)免疫BALB/c小鼠,通过ELISA筛选获得6株单抗,其中4株(1H10、2D5、2A9和2C6)属于Ig G1亚型,2株(2D1和2F5)Ig G2a亚型。通过ELISA检测分析显示均与HA蛋白具有强亲和力,其中2D1的效价达2×10ug/m L。免疫荧光实验表明所有单抗与其他亚型流感病毒无交叉反应,具有较好特异性。第二部分,H7N9病毒胶体金试纸条和ELISA试剂盒研制。基于抗体特性和配对实验,单抗2D5和2F5分别作为捕获抗体和检测抗体,组装了胶体金试纸条和ELISA试剂盒,两种方法检测H7N9病毒(A/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013)的灵敏度分别为2和2HAU/100u L。对检测H7N9病毒特异性好,具有潜在应用价值。第三部分,单抗对感染H7N9病毒小鼠的预防和治疗作用。用5倍半数致死剂量的高致病性H7N9病毒感染小鼠,再以10mg/kg剂量的抗体治疗,单抗1H10和2D1分别通过中和作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用,对小鼠能起到了有效保护作用。提示这两株单抗对高致病性H7N9病毒具有保护作用。综上所述,本研究得到以下结论:(1)本研究获得6株单抗,均能特异性识别H7N9病毒,具有较好亲和力。(2)利用单抗2D5和2F5,组装了检测H7N9病毒的胶体金试纸条和ELISA试剂盒,为H7N9疫情防控提供技术支持。(3)单抗1H10和2D1具有显著的预防和治疗效果,具有潜在的应用前景。

关键词：禽流感病毒 H7N9 检测治疗单克隆抗体胶体金试纸条 ELISA试剂盒中和作用抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用

抗CD52单克隆抗体ADCC转基因测活方法的建立

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微生物学免疫学进展 2019年第5期47卷 27-33页

作者：刘春雨于传飞崔永霏肖启东黄璟王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定方法及标准化重点实验室

目的建立转基因细胞法测定抗CD52单克隆抗体(单抗)的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法 ①以Ramos细胞系作为靶细胞,以Jurkat-hFcγRⅢa/FcεRIγ-NFAT转基... 详细信息

目的建立转基因细胞法测定抗CD52单克隆抗体(单抗)的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法 ①以Ramos细胞系作为靶细胞,以Jurkat-hFcγRⅢa/FcεRIγ-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,通过荧光素酶检测系统(Bright-GloTM luciferase Assay System)建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法;②对靶细胞、量效范围、效靶比及诱导时间进行优化并进行方法学验证;③研究建立的方法应用于对不同抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测。结果建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法,抗CD52单抗在该方法中存在量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D;经优化后确定抗体量效范围为起始质量浓度360μg/mL,4倍系列稀释9个稀释度;效靶比为3∶1,诱导时间为6.0h;该方法具有良好的专属性;4个不同稀释组回收率样品经3次测定,相对效价分别为(45.58±4.67)%、(71.61±9.45)%、(122.92±7.92)%和(149.94±14.58)%;对应的回收率分别为(91.16±9.34)%、(95.49±12.60)%、(98.34±6.34)%和(99.96±9.72)%,上述结果的变异系数(coefficientofvariation,CV)均小于15%;且该方法也适用于不同抗CD52单抗的ADCC效应评价。结论利用转基因细胞法成功建立了抗CD52单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD52单抗的ADCC生物学活性。

关键词：抗CD52单克隆抗体单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用生物学活性报告基因