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短内含子剪接调控元件的系统性特征分析

短内含子剪接调控元件的系统性特征分析

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作者：杨阳苏州大学

学位级别：硕士

背景与目的:前体信使RNA(pre-mRNA)剪接是去除内含子,将外显子连接的过程,是真核基因表达转录后水平调控的重要环节。人类基因组中,大多数内含子的平均长度是外显子的10倍以上。剪接依赖于剪接体从成千上万的内含子核苷酸中正确识别外... 详细信息

背景与目的:前体信使RNA(pre-mRNA)剪接是去除内含子,将外显子连接的过程,是真核基因表达转录后水平调控的重要环节。人类基因组中,大多数内含子的平均长度是外显子的10倍以上。剪接依赖于剪接体从成千上万的内含子核苷酸中正确识别外显子。外显子主要由4种核心剪接信号定义,包括5’剪接位点(5’splice site,5’ss)、3’剪接位点(3’splice site,3’ss)、分支点序列和多嘧啶区(PPT)。除此之外,还需要剪接调控元件(splicing regulatory elements,SRE)作为辅助性元件。剪接调控元件为位于外显子的剪接增强子或沉默子(exonic splicing enhancer/silencer,ESE/ESS),位于内含子的剪接增强子或沉默子(intronic splicing enhancer/silencer,ISE/ISS)。RNA结合蛋白(RBP)作为剪接调控因子与SRE结合促进或抑制剪接位点的识别。SRE通常是短序列,发生突变或与之结合的RBP失调,会产生剪接异常并导致疾病。然而,迄今为止,关于SRE序列及其如何调节剪接的知识仍然有限。方法:以运动神经元生存2(survival of motor neuron 2,SMN2)小基因(minigene)为研究模型,在内含子7的5’SS下游的第11-15位进行突变,构建一个完整的五聚体序列库,该库包含该突变位置的5个核苷酸的所有组合。将获得的1023个五碱基突变体和野生型小基因(WT SMN2)转染到HEK293细胞中,用荧光标记的半定量RT-RCR方法和非变性PAGE胶检测各五聚体序列对外显子7剪接的影响。利用了基序集富集分析(MSEA)方法,对数据库分析,从中识别出了对SMN2外显子7列入具有促进性和抑制性的SRE基序。最后在SMN1/2和MAPT小基因中验证得到的SRE对剪接的影响。结果:根据ΔPSI值(PSI:外显子7的列入率,ΔPSI:突变体的PSI与WT的PSI之差),从五聚体序列库中得到584个对SMN2外显子7列入具有促进性的五聚体和230个对SMN2外显子7列入具有抑制性的五聚体。从位置依赖分析和非位置依赖分析这两个层面,采用MSEA方法,富集到四类促进性基序包括U-rich,C-rich,CG-core和RBFOX相关序列,以及四类抑制性基序包括AG-core,UG-type,GCWCC-type和GAC-core。将 U-rich,C-rich,CG-core,UG-type,GCWCC-type分别在SMN1/2或MAPT小基因中验证。U-rich,C-rich都明显促进外显子7列入,且随着U-rich和C-rich序列的延长,促进外显子7列入的作用越强。CG的三重复序列(CGCGCG)在SMN2小基因中明显促进外显子7列入,在MAPT小基因中明显抑制外显子10列入。GCWCC在SMN2小基因和MAPT小基因中都强烈抑制盒式外显子列入。UG-type基序抑制外显子7列入的剪接效应存在两种机制,即二级结构干扰和自身序列携带的抑制信号。结论:五聚体库所有序列由ΔPSI值分析可分为SMN2外显子7促进性和抑制性两种类别序列,再结合MSEA分析,从五聚体序列库富集到具有SMN2外显子7促进性和抑制性的3聚体(3-mer)或4聚体(4-mer),我们发现了短序列中存在以下关键 SRE:U-rich,C-rich,CG-core 和 RBFOX 相关序列为强 ISE,而 AG-core,UG-type,GCWCC-type,和GAC-core为强ISS。从五聚体序列库中获得大量的剪接调控元件数据,对理解短RNA序列如何调控剪接具有重要的理论价值,同时可以作为一种宝贵的资源为其他复杂的剪接调控机制提供解释。在此基础上,可以进一步探索新发现的SRE在特定基因表达中的作用,以阐明其作用机理和生物学意义。

关键词：五聚体库 SMN2 MSEA 剪接调控元件促进性基序抑制性基序

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