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木本曼陀罗托品酮还原酶ⅰ基因克隆及功能验证

木本曼陀罗托品酮还原酶Ⅰ基因克隆及功能验证

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作者：夏科西南大学

学位级别：硕士

托品烷类生物碱(Tropane alkaloids,TAs)主要提取自茄科植物,包括莨菪碱(hyoscyamine)、山莨菪碱(anisodamine)和东莨菪碱(scopolamine),而莨菪碱和东莨菪碱是两种作为抗胆碱药物而被广泛应用于副交感神经系统,因而临床上常应用于镇痛... 详细信息

托品烷类生物碱(Tropane alkaloids,TAs)主要提取自茄科植物,包括莨菪碱(hyoscyamine)、山莨菪碱(anisodamine)和东莨菪碱(scopolamine),而莨菪碱和东莨菪碱是两种作为抗胆碱药物而被广泛应用于副交感神经系统,因而临床上常应用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等。山莨菪碱作为非特异性胆碱受体拮抗剂,其药理性与莨菪碱相似,然而东莨菪碱与莨菪碱相比较,其在临床上具有药效更强而副作用更小的特点,因而具有更大的市场价值。但是在茄科植物中东莨菪碱的含量极低,而利用人工合成的方法其成本太高且困难,因而在茄科植物中,通过代谢工程以获得高产东莨菪碱的药用植物将成为我们研究的一个方向。木本曼陀罗(Brugmansia arborea)属于茄科(solananaceac)曼陀罗属(Datura)的植物,根据前人报道的文献可知,木本曼陀罗的东莨菪碱含量极高,其化学型属于东莨菪碱型,因而我们以此为研究材料,通过同源物种(Datura stramonium和Datura innoxia)的托品酮还原酶ⅰ(tropinone reductase I,TRI)基因序列比对,并分析保守区域的基因序列,利用RACE的方法,从***中克隆而获到一条TRI序列,BaTRI全长序列为1138-bp,包括41-bp的5’UTR、278-bp的3’UTR和819-bp的开放性阅读框(Open Reading Frame,ORF),该编码区能编码272个氨基酸,通过与其它已知的TRI氨基酸序列进行比对分析后,该氨基酸序列具有TRI功能必需的的结构域;通过体外重组技术,并在Rosstar中高效表达BaTRI,能纯化出大小约为30kDa的重组蛋白,与预测的29.7kDa相一致,同时为了与已经报道的DsTRI进行比较,我们从***中克隆并获得编码DsTRI基因序列;对重组BaTRI酶动力学参数进行测定,其结果显示:以托品酮作为测定底物时,BaTRI的高还原活性能维持在一个很宽的pH范围(从6.8-8.0),而在8.0时活性最高,当以托品作为测定底物时,BaTRI的高氧化活性只能维持在一个很小的pH范围,而在9.6时活性最高。我们以6.4(植物的生理活性pH)作为酶动力学测定值,BaTRI对托品酮底物的Km、Vmax和Kcat分别为2.65 mM、88.30 ***-1和2.93 S-1,同时,也对两种托品酮的底物类似物进行了测定:4-甲基环己酮(4-methylcyclohexanone)和3-奎宁环酮盐酸盐(3-quinuclidinone hydrochloride),它们分别为单列酮和双环酮的典型底物,常被用于托品酮还原酶的鉴定。此外,在9.6时还测定了BaTRI对托品的相关酶动力学参数,其Km、Vmax和Kcat分别为0.56 mM、171.62 ***-1和0.54 S-1,结果显示BaTRI对托品的Km小于BaTRI对托品酮Km,但是两个反应的pH不一样,BaTRI对托品酮的反应处在弱酸性而BaTRI对托品的反应却处在强碱性,当在弱酸性范围时BaTRI对托品反应极低,而植物的生理PH为6.4,说明在***体内主要是还原反应占主导优势。为了与DsTRI进行酶活性比较,相同条件下,测定了DsTRI对托品酮底物的Km、Vmax和Kcat,它们的值分别为4.18 mM、81.20 ***-1和2.40 S-1,测定的结果显示BaTRI的Km小于DsTRI的Km,说明BaTRI对托品酮的亲和力更高,为了更好的说明BaTRI还原活性高于DsTRI,在6.4、6.8和7.0时同时测定了BaTRI和DsTRI对5mM托品酮的Kcat,结果显示BaTRI在6.4、6.8和7.0时对5mM托品酮的Kcat都高于DsTRI的Kcat,说明BaTRI对托品酮的催化效率更高,从而显示BaTRI的活性高于DsTRI;利用qPCR方法研究BaTRI在各组织中的表达情况,结果显示,BaTRI在各组织中都有表达,而在须根中的表达量最高,其表达模式与之前我们实验组所报道的BaH6H表达模式相一致,但是与所报道的几个草本物种的表达模式有很大区别;利用HPLC分析各组织中TAs的含量,结果显示,***主要含有东莨菪碱,而叶片和茎枝中的含量高于其他部位,说明***与***和Hyoscyamus Niger一样,其化学型属于东莨菪碱型植物。BaTRI的表达模式和TAs的含量分布说明,在***中,地下部分是TAs合成的主要场所,地上部分也同时参与了TAs的合成。本文通过对BaTRI功能验证的研究,可以确定木本

关键词：木本曼陀罗托品烷类生物碱托品酮还原酶ⅰ 酶动力学东莨菪碱

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颠茄pmt、trI、h6h双基因策略对颠茄毛状根托品烷类生物碱含量的影响

颠茄pmt、trI、h6h双基因策略对颠茄毛状根托品烷类生物碱含量的...

引用

作者：卢衍西南大学

学位级别：硕士

颠茄是我国药典规定托品烷类生物碱来源的唯一药用植物,也是莨菪碱、东莨菪碱最主要的商业药源（国家药典委员会2011版）。与莨菪碱相比,东莨菪碱副作用小、药理作用强,所以需求量十分巨大。野生颠茄中东莨菪含量非常低,而在商用栽培颠... 详细信息

颠茄是我国药典规定托品烷类生物碱来源的唯一药用植物,也是莨菪碱、东莨菪碱最主要的商业药源（国家药典委员会2011版）。与莨菪碱相比,东莨菪碱副作用小、药理作用强,所以需求量十分巨大。野生颠茄中东莨菪含量非常低,而在商用栽培颠茄中,东莨菪碱含量也仅为干重的0.01-0.08%。近年来,随着托品烷类生物碱生物合成途径分子生物学研究的深入,使得在分子水平实现包括莨菪碱和东莨菪碱在内的TAs生物合成的代谢调控取得了重要进展。特别是目前东莨菪碱代谢途径上的一些功能基因的确定,为利用托品烷类代谢工程技术提高颠茄中东莨菪碱含量打下了基础。在托品烷类生物碱代谢途径中,pmt、trI和h6h是重要的基因。其中,pmt为上游重要基因,trI为中间分支点基因,h6h为下游重要基因。研究表明,在颠茄毛状根和颠茄植株中,外源pmt、trI、h6h的高度表达对莨菪碱和东莨菪碱含量的变化都是有所相关的：将烟草pmt基因转入白曼陀罗,莨菪碱的含量提高2倍多,东莨菪碱的含量提高3倍多;在颠茄中高度表达曼陀罗trI,莨菪碱的含量提高了3倍多,东莨菪碱的含量提高了5倍多;将莨菪的h6h导入到埃及莨菪中,最好的克隆产生了17mg/L的东莨菪碱,是对照克隆的100倍以上。而内源基因在其中的作用尚不清楚。针对这点,在之前研究基础上,本文通过内源pmt、trI、h6h的双基因策略研究对颠茄毛状根莨菪碱和东莨菪碱含量的影响。分别构建携带目的基因的植物高效双元表达载体p1304+-pmt-trI、p1304+-pmt-h6h和p1304+-trI-h6h,转化“卸甲”的根癌农杆菌C58C1获得工程菌C58C1-p1304+-pmt-trI、C58C1-p1304+-pmt-h6h和C58C1-p1304+-trI-h6h,遗传转化颠茄叶片。在C58C1-p1304+-pmt-trI组合中,经检测rolC、hygr和pmt、trI基因后成功筛选出6个转基因发根系,分别进行液体培养基扩大培养然后检测托品烷类生物碱（TAs）含量和基因表达量。其中有4个发根系的总TAs含量得到了提高,依次为PT11＞PT17＞PT13＞T3,PT11的总TAs含量约为空菌发根对照（NC）的2.5倍;有2个发根系的含量维持不变或明显降低,但东莨菪碱的含量有所提高。莨菪碱和东莨菪碱含量提高最多的PT11相比空白对照分别提高了2倍和5.7倍。基因表达量上,除了PT2的pmt基因表达量较空白发根低,其他转基因发根系的pmt和h6h基因的表达量都比空白对照高。在C58C1-p1304+-pmt-h6h组合中,经检测rolC、hygr和pmt、h6h基因后成功筛选出5个转基因发根系,分别进行液体培养基扩大培养然后检测TAs含量和基因表达量。其中有2个发根系的总TAs含量得到了提高,为PH2＞PH14,PH2的总TAs含量约为空菌发根对照（NC）的2.7倍;有3个发根系的含量维持不变或明显降低,但东莨菪碱的含量有所提高。在这5个发根系中,莨菪碱和东莨菪碱含量提高最多的PH2比空白对照分别提高了1.8倍和8.2倍。除了PH32的pmt基因表达量低于空白对照,其余转基因发根系的pmt和h6h基因表达量都有所提高或持平。在C58C1-p1304+-trI-h6h组合中,经检测rolC、hygr和trI、h6h基因后成功筛选出4个转基因发根系,分别进行液体培养基扩大培养然后检测TAs含量和基因表达量。其中有3个发根系的总TAs含量得到了提高,为HT2＞HTA1＞HTA3＞HT16,HT2的总TAs含量约为空菌发根的2.6倍;有1个发根系的含量降低,但东莨菪碱的含量有所提高。莨菪碱和东莨菪碱含量提高最多的HT2比NC分别提高了2.1倍和5.6倍。HT2的h6h表达量为最高,其东莨菪碱含量也为最高,HTA1、HTA3、HT16的h6h基因表达量与NC接近,但trI基因的表达量有很大的提高。上述基因的具体表达量与含量水平之间并不完全一致,这可能是由于双转的基因在表达上产生了共抑制,使转基因发根在基因的高表达下反而含量保持不变或有所降低。但总体上,双基因策略在托品烷类生物碱合成途径中可能存在协同作用。转基因发根个体间托品烷类生物碱合成能力有个体差异,但是并没有改变两个基因过量表达能够提高东莨菪碱含量的趋势,说明双基因的遗传转化能够打破颠茄托品烷类生物碱合成途径中的限速反应步骤,从而推动代谢流更多的向托品烷类生物碱合成方向流动,提高了莨菪碱和东莨菪碱合成能力,最终表现为两者含量的提高。 pmt是东莨菪碱生物合成途径中的第一个重要酶基因,其过量表达能够为下游的东莨菪碱合成提供更为充足的前体物质;trI是东莨菪碱生物合成途径中的一个分支点,使代谢流更多的流向东莨菪碱;h6h是该途径中的最后一个重要酶基因,其超量表

关键词：颠茄托品烷类生物碱 1,4丁二胺-氮-甲基转移酶托品酮还原酶ⅰ 莨菪碱6β-羟化酶

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三分三毛状根中托品烷生物碱不同成分间的生物转化研究

三分三毛状根中托品烷生物碱不同成分间的生物转化研究

引用

作者：杨胜上海师范大学

学位级别：硕士

托品烷生物碱(tropane alkaloids)是一类作用于副交感神经系统的抗胆碱药,广泛地存在于茄科植物中,包括:山莨菪碱(anisodamine)、樟柳碱(anisodine)莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)。其中,莨菪碱和东莨菪碱已经被长期大量... 详细信息

托品烷生物碱(tropane alkaloids)是一类作用于副交感神经系统的抗胆碱药,广泛地存在于茄科植物中,包括:山莨菪碱(anisodamine)、樟柳碱(anisodine)莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)。其中,莨菪碱和东莨菪碱已经被长期大量地应用,但是随着科技地不断发展,山莨菪碱和樟柳碱的功能渐渐被发现,他们除了具有抗胆碱的活性外,还具有改善微循环的作用,临床可用于治疗微循环障碍性疾病;还可用来治疗青光眼等。此外,他们还对油酸所引起的急性肺损伤和急性肾衰时肾微血管的损伤具有保护作用。最重要的是,与东莨菪碱相比,山莨菪碱毒性低,对中枢神经的副作用小。因此,四种生物碱都具有巨大的医用和商业价值。三分三(Anisodus acutangulus)是我国云南特有的茄科多年生的药用植物,由于它可以产生较高含量的托品烷生物碱而被重视。尤其是三分三中的莨菪碱,是所有茄科植物中最高的,但是其他三种托品烷生物碱含量却很低,因此,利用基因工程手段来提高山莨菪碱,樟柳碱,东莨菪碱的研究是具有重要价值的。首先,本研究利用从药用植物三分三根部克隆得到的限速酶基因AaPMT和AaTRI基因的编码框序列构建含AaPMT和AaTRI基因的植物双价高效表达载体,通过发根农杆菌介导,对三分三外植体进行双基因转化,从而获得转AaPMT和AaTRI基因的三分三毛状根,通过半定量和定量RT-PCR的方法分析目的基因在转基因毛状根中的表达情况,高效液相色谱法测定转基因毛状根中托品烷生物碱(莨菪碱,山莨菪碱,樟柳碱和东莨菪碱)含量。本课题获得的三分三转基因毛状根中托品烷生物碱的平均含量明显提高,其中的一个株系(PT18),其托品烷生物碱含量为对照的8.7倍,特别是东莨菪碱和樟柳碱,他们的含量提高最为明显,分别为对照组的49.8和19.6倍。而且通过抗氧化研究实验得知,转基因株系中由于托品烷生物碱的含量的提高导致了其抗氧化能力也大大提高了。因此,这个课题提供了一种提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量和抗氧化能力的方法,从而为临床所需求的托品烷生物碱提供了更多的来源和巨大的商业需求。其次,本研究验证了AaTRI对托品烷生物碱含量的影响。构建两个植物表达载体,分别含AaTRI(正)、AaTRI(反)基因的编码框序列,然后分别导入发根农杆菌,从而获得转基因毛状根系。转AaTRI(正)基因的毛状根中托品烷生物碱的平均含量较对照明显提高,其中的一个株系(T12),其托品烷生物碱含量为对照的2.8倍。相反,转AaTRI(反)基因的毛状根中托品烷生物碱的平均含量较对照明显降低,其中的一个株系(T21反),其托品烷生物碱含量为对照的11.6%。由以上结果可得出托品烷生物碱含量从高到低排列为:AaTRI(正)的毛状根>非转基因毛状根>含AaTRI(反)的毛状根。再次,我们还把不同浓度的四种托品烷生物碱的标准品分别加入到了含有非转基因三分三毛状根的培养基中,共培养一段时间后,通过RT-PCR的方法分析托品烷生物碱代谢通路中关键酶基因的表达情况,高效液相色谱法测定加入底物后的毛状根中托品烷生物碱(莨菪碱,山莨菪碱,樟柳碱和东莨菪碱)含量。结果表明,所加入的托品烷生物碱标品都会大大增加毛状根中山莨菪碱,樟柳碱和东莨菪碱的含量,尤其是当把10μM东莨菪碱标品加入到培养基中,毛状根中的东莨菪碱和樟柳碱的含量提高最为明显,分别为对照组的7.2和8.1倍。同时根据基因表达谱和生物碱含量分析,我们提出了樟柳碱可能的代谢途径。因此,这个课题不但提供了一种除了转基因方法之外的另外一种提高三分三毛状根托品烷生物碱含量方法,而且对樟柳碱和东莨菪碱之间的转化关系进行了进一步研究。

关键词：三分三毛状根山莨菪碱樟柳碱莨菪碱东莨菪碱腐胺-N-甲基转移酶托品酮还原酶ⅰ 生物转化

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