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中国骨质疏松杂志 2023年第8期29卷 1106-1113,1128页

作者：温蕊嘉董鑫庄皓文王俊岩张锦芳广州中医药大学第一临床医学院广东广州510405 广州中医药大学第一附属医院广东广州510405 广州中医药大学中药学院广东广州510006 广州中医药大学深圳医院(福田) 广东深圳518000

目的探讨壮筋养血汤(Zhuangjin Yangxue Decoction,ZJYXD)通过LncRNA ANRIL介导的MAPK/P38-ERK通路调控成骨成脂分化的作用机制。方法提取骨髓间充质干细胞(BMSCs),并采用ANRIL慢病毒转染BMSCs;制备ZJYXD含药血清用于培养转染后的BMSCs... 详细信息

目的探讨壮筋养血汤(Zhuangjin Yangxue Decoction,ZJYXD)通过LncRNA ANRIL介导的MAPK/P38-ERK通路调控成骨成脂分化的作用机制。方法提取骨髓间充质干细胞(BMSCs),并采用ANRIL慢病毒转染BMSCs;制备ZJYXD含药血清用于培养转染后的BMSCs。通过CCK-8检测BMSCs增殖活力;运用碱性磷酸酶、茜素红及油红O染色检测各组细胞成骨成脂分化情况;通过qRT-PCR、Western Blot法检测成骨、成脂、MAPK/P38-ERK信号通路相关基因及蛋白的表达。选取24只SPF级C57BL/6雄性小鼠用于制作股骨横断骨折模型,造模后给予不同转染的BMSCs治疗并给予ZJYXD。通过X-ray与Micro-CT检测对照组、对照组+ZJYXD组、ANRIL过表达组、ANRIL过表达+ZJYXD组小鼠骨愈合情况。结果与0%含药血清相比,6%ZJYXD含药血清对BMSCs细胞增殖能力最强(P成骨染色加深,成骨相关基因OPN、RUNX2 mRNA及蛋白表达显著升高(P成脂染色减弱,相关基因PPARγ、C/EBPαmRNA及蛋白表达显著降低(P成骨成脂细胞分化作用消失,无法有效的促进骨折愈合。结论壮筋养血汤具有促进成骨分化、抑制成脂分化的作用,而这种作用通过LncRNA ANRIL调控MAPK/P38-ERK信号通路实现。

关键词：壮筋养血汤 LncRNA ANRIL MAPK/P38-ERK信号通路成骨成脂分化

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PIEZO1介导微环境刚度影响骨肉瘤成骨成脂分化的机制研究

PIEZO1介导微环境刚度影响骨肉瘤成骨成脂分化的机制研究

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作者：王美婧吉林大学

学位级别：硕士

研究背景:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是起源于成骨细胞或向成骨分化的间叶性恶性肿瘤,其特征是瘤细胞直接产生骨样组织或骨质。鉴于大多数OS在组织病理学上分化不良,分化治疗被视为治疗OS的一个新手段。全反式维甲酸是分化治疗中应用广泛... 详细信息

研究背景:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是起源于成骨细胞或向成骨分化的间叶性恶性肿瘤,其特征是瘤细胞直接产生骨样组织或骨质。鉴于大多数OS在组织病理学上分化不良,分化治疗被视为治疗OS的一个新手段。全反式维甲酸是分化治疗中应用广泛的分化诱导剂,但在临床应用中已发现其药物不良反应。研究发现力学信号能够调控成骨成脂分化,并可避免药物治疗引起的不良反应。PIEZO1和整合素β1(integrinbeta 1,ITGB1)作为间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中力学信号的感受器,可以将力学信号如微环境刚度,转化为化学信号传递给细胞内下游分子;HIPPO通路中的yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)能够易位至细胞核,并将信号传递至核内;组蛋白三甲基化修饰H3K4me3与成骨分化有关,H3K27me3与促进脂肪形成和抑制成骨分化有关。因此,在微环境刚度调控OS细胞成骨成脂分化过程中,探讨PIEZO1和整合素之间的关系及下游调控机制十分有必要。研究目的:探索微环境刚度对调控OS成骨成脂分化的作用,其中PIEZO1、整合素及表观遗传机制。研究方法:1.构建软硬两种不同刚度的水凝胶基质,分别模拟脂肪刚度和钙化前骨刚度,生物纳米压痕仪检测水凝胶的弹性模量;2.软/硬基质上培养OS细胞系U-2 OS细胞,Western Blot检测PIEZO1、ITGB1、组蛋白甲基化修饰酶EZH2、KDM6A、KDM5B、二价结构域H3K27me3/H3K4me3和成骨成脂分化指标的蛋白表达;3.茜素红染色检测细胞钙盐沉积、油红O染色检测细胞脂滴生成能力;4.激光共聚焦检测PIEZO 1和整合素定位情况;5.硬基质上敲低PIEZO1,软基质上添加Yoda1激活PIEZO1,Western Blot检测PIEZO1、ITGB1、组蛋白甲基化修饰酶表达,茜素红染色检测细胞钙盐沉积,油红O染色和尼罗红染色检测细胞脂质沉积;6.免疫荧光和Western Blot检测YAP和p-YAP的定位与蛋白表达。结果:1.成功构建了1.8-2.1kPa和10.8-15.3kPa刚度的水凝胶;2.刚度影响细胞形态和成骨成脂分化,硬基质上细胞呈上皮样,软基质上细胞呈脂肪样;硬基质促进细胞成骨分化,软基质促进细胞成脂分化;3.硬基质上高表达PIEZO1和ITGB1,并促进YAP入核,抑制EZH2表达,促进H3K4me3表达,抑制H3K27me3表达;***1和PIEZO1可能有相关性。研究结论:***细胞分化受到刚度调控,硬基质上趋向成骨分化,软基质上趋向成脂分化;2.刚度通过力学敏感离子通道PIEZO1调控ITGB1、YAP发挥作用,组蛋白甲基化酶EZH2影响H3K27me3,上述分子可能成为OS治疗的新靶点。研究意义:为OS提供潜在的治疗靶点,为基于诱导肿瘤细胞分化的治疗策略提供新的思路。

关键词：微环境刚度骨肉瘤成骨成脂分化 PIEZO1 ITGB1 YAP

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NDRG2调节骨髓间充干细胞成骨成脂分化机制的研究

NDRG2调节骨髓间充干细胞成骨成脂分化机制的研究

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作者：杲丽第四军医大学

学位级别：硕士

骨质疏松症（Osteoporosis）是一种以骨生成和骨吸收平衡破坏为特征的慢性炎症性疾病。目前，能够引起骨质疏松发病的因素有很多，包括年龄，雌激素缺乏和炎症性疾病等。骨髓间充质干细胞（BMMSCs）作为成骨细胞和骨细胞的前体细胞，其... 详细信息

骨质疏松症（Osteoporosis）是一种以骨生成和骨吸收平衡破坏为特征的慢性炎症性疾病。目前，能够引起骨质疏松发病的因素有很多，包括年龄，雌激素缺乏和炎症性疾病等。骨髓间充质干细胞（BMMSCs）作为成骨细胞和骨细胞的前体细胞，其分化能力的变化对骨的生长和发育有着至关重要的影响。因此，研究骨髓间充质干细胞在疾病中生物学行为的变化及其作用机制，提高其成骨分化的能力，对于治疗骨性疾病有着深远的意义。 NDRG2属于NDRG（The N-myc downstream regulated gene）家族,是近年来越来越受到关注的一个基因，其在细胞的增殖、分化、凋亡过程中均发挥着作用，尤其在癌症发生过程中的作用被越来越多的文章报道，甚至有学者提出，NDRG2可能将会成为判断癌症预后的指标。本课题组前期研究结果和文献报道均表明，NDRG2能都调节骨早期的生长和发育，并且在正常和患有疾病的骨组织中NDRG2的表达有差异，在成骨和破骨细胞中，NDRG2的表达也不同。但是在骨质疏松疾病中，NDRG2是否调控了BMMSCs成骨成脂分化以及如何调控分化，它的表达和功能的变化是否受到其他因素的调节，以及是怎样调节的，目前还没有明确。研究NDRG2对BMMSCs分化能力的调控以及在骨质疏松疾病状态下表达和功能的异常，对于探究BMMSCs成骨分化机制以及探索新的治疗靶点具有指导意义。研究目的： 1.探讨NDRG2在BMMSCs成骨分化过程中的表达;2.探讨NDRG2调控BMMSC成骨分化的机制;3.探讨NDRG2在骨质疏松疾病中表达和功能的异常及其作用机制。研究方法： 1.利用密度梯度法分离、纯化、培养mBMMSCs,流式细胞技术检测细胞表面标志物，成骨成脂诱导检测mBMMSCs的分化能力，RT-PCR检测成骨成脂诱导后标志性基因的表达。 2.利用RT-PCR检测NDRG2在mBMMSCs成骨成脂分化过程中表达的变化，通过慢病毒转染技术上调/下调NDRG2的表达，体外检测NDRG2成骨成脂能力的变化;ALP、茜素红和油红O观察碱性磷酸酶、钙化结节和脂滴的形成情况，RT-PCR和Western Blot检测成骨标志性基因Runx2、Osterix和PPAR的表达 3.在骨质疏松疾病模型中探索NDRG2调节mBMSCs的作用机制。分离和培养正常和患有骨质疏松小鼠的BMMSCs,对两组细胞成骨成脂能力进行比较，检测两种细胞中NDRG2的表达差异。体外模拟炎症环境，检测NDRG2的表达，通过相关通路抑制剂的加入，观察成骨基因的变化，通过NDRG2的变化，寻找参与NDRG2调控BMMSCs分化的信号通路并探索其作用机制。通过慢病毒转染的方式上调/下调NDRG2的表达,检测成骨基因表达的差异以及这种差异受外界环境的影响变化。实验结果： 1.通过分离培养的mBMMSCs表达间充干细胞表面标志物而不表达其他造血系干细胞标志物，成骨成长诱导分化后，ALP，茜素红，油红O染色证明其具有成骨成脂分化的能力。 2.通过芯片及RT-PCR验证分析发现，NDRG2在成骨诱导以后表达升高。通过对其功能分析发现，高表达NDRG2能够抑制BMMSCs的体外成骨分化促进其成脂分化，而下调NDRG2能够促进BMMSCs的成骨分化抑制其成脂分化。 3.骨质疏松小鼠（早衰性和雌激素缺乏性）的骨髓间充质干细胞与正常小鼠的骨髓间充质干细胞相比，其成骨能力下降成脂能力增加;NDRG2在骨质疏松小鼠的BMMSCs表达升高。LiCL, TNF-α抑制BMMSC的分化能力，体外环境中加入LiCL，NDRG2的表达没有明显变化;加入TNF-α，NDRG2的表达下降。通过转染NDRG2，能够逆转TNF-α对BMMSC的作用。结论： 1. NDRG2能够抑制BMMSCs的体外成骨能力促进成脂能力。 2. NDRG2在正常和患有骨质疏松症小鼠中的表达存在差异。 3. NDRG2受TNF-α的调节，NDRG2调控BMMSCs分化的过程与NF-κB信号通路有关，与WNT信号通路无明显关系。

关键词： NDRG2 骨髓间充干细胞成骨成脂分化 TNF-α

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复方补肾活血颗粒含药血清经β-catenin/TRIB3调控人骨髓间充质干细胞成骨成脂分化

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安徽中医药大学学报 2024年第5期43卷 78-85页

作者：胡芷苜王久香江渟安徽中医药大学研究生院安徽合肥230012 安徽中医药大学第一附属医院安徽合肥230031

目的探讨复方补肾活血颗粒(Compound Kidney-invigorating Granule,CKG)含药血清基于β-catenin/tribbles假激酶3(tribbles pseudokinas 3,TRIB3)调控人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨成脂分化的作用机制。方法纯化原代BMSCs;BMSCs转染β-catenin-siRNA,成骨诱导后,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色观察BMSCs成骨分化情况,qPCR法、Western blot法分别检测β-catenin、TRIB3、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、ALP mRNA及蛋白表达水平;Western blot法检测CKG对BMSCs中β-catenin及TRIB3蛋白表达水平的影响;BMSCs转染β-catenin-siRNA,CKG含药血清培养后,ALP染色、茜素红染色及油红O染色观察BMSCs成骨成脂分化情况,qPCR法、Western blot法分别检测β-catenin、TRIB3、OPN、RUNX2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、adiponectin mRNA及蛋白表达水平。结果BMSCs转染β-catenin-siRNA后,ALP活力金氏单位值显著降低(P成减少,TRIB3、OPN、RUNX2、ALP mRNA及蛋白表达水平降低(P脂肪粒数量多于5%含药血清组,低于0%含药血清组;5%含药血清+siRNA组TRIB3、OPN、RUNX2 mRNA和蛋白表达水平,ALP活力金氏单位值显著高于0%含药血清组(P成骨分化能力,降低TRIB3的表达;CKG含药血清促进BMSCs中β-catenin与TRIB3的表达;CKG含药血清可以调控BMSCs成骨成脂分化,其作用机制可能与β-catenin/TRIB3通路相关。

关键词：骨质疏松症复方补肾活血颗粒骨髓间充质干细胞 β-catenin TRIB3 成骨成脂分化

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小鼠胚胎干细胞条件培养基促进人脂肪干细胞增殖

小鼠胚胎干细胞条件培养基促进人脂肪干细胞增殖

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作者：李佳成暨南大学

学位级别：硕士

目的：用小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，mES）条件培养液（conditionmedium，CM）培养人脂肪干细胞（human adipose derived stem cells，hADSC），检测hADSC的增殖速率，试图找到一种能够促进hADSC快速增殖并不影响细胞... 详细信息

目的：用小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，mES）条件培养液（conditionmedium，CM）培养人脂肪干细胞（human adipose derived stem cells，hADSC），检测hADSC的增殖速率，试图找到一种能够促进hADSC快速增殖并不影响细胞性质的方法。方法：hADSC提取培养及鉴定——hADSC分离传代培养;MTT法检测hADSC的增殖活性;hADSC的细胞表面标记和细胞周期的流式细胞仪的检测;成骨成脂分化能力分别用茜素红和油红O染色进行鉴定。mES未分化状态的鉴定以及条件培养基的制备——mES培养液中添加LIF（leukemia inhibitory factor）培养在饲养层上传代，抑制细胞分化;mES的RNA提取后用PCR鉴定其多能性因子的表达情况;收集培养了未分化状态的mES24h后的培养液，过滤后即为CM培养液（condition medium）。CM培养液培养hADSC，检测生化分子指标——将hADSC分为三组，分别用hADSC培养液、40%CM培养液和40%ES培养液来进行培养，分为ADSC组，CM组，ES组。流式细胞仪检测三组细胞表面标记，PCR检测hADSC的细胞特异性表达基因c-kit和sca-1的表达用来鉴定细胞性质变化;用MTT检测三组细胞增殖速率，三组细胞计数制备生长曲线，通过流式细胞仪检测细胞周期;Q-PCR检测三组细胞多能性因子nanog，OCT-4的表达量;用PCR检测细胞凋亡标志基因caspase-3s，Q-PCR检测caspase-3的表达，流式细胞仪检测P3、P15代的hADSC的凋亡;用Q-PCR检测hADSC成骨分化0d、7d、14d的ALP，collagen type I，OPN，RUNX-2的标志基因的表达量的检测，细胞在诱导21d时进行茜素红的染色;hADSC成脂诱导分化14d后进行油红O染色。结果：***结果显示，hADSC增殖曲线呈S形，增殖情况良好;流式细胞仪检测表面因子表明CD29、CD44、CD73、CD90和CD105表面标记阳性表达，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR表面标记因子阴性表达;流式细胞仪检测hADSC细胞周期表明（87.3±0.48）%的细胞处于G1期、（5.3±0.84）%的细胞处于G2期以及（7.4±0.35）%的细胞处于S期;茜素红S染色，油红O染色结果显示hADSC具有向成骨和成脂分化的能力，符合间充质干细胞的基本性质。***的细胞集落呈圆形突起状生长，球形饱满，克隆的边缘光滑且细胞核质比高，有较好的折光率。其多能性基因nanog、OCT-4、sox-2高表达。收集该细胞状态下的ES细胞培养24h后的培养液，0.22um的滤器过滤除去其中可能混有的胚胎干细胞。3.流式细胞仪检测三组表面标记结果显示，经CM培养后的ADSC，其阳性表达细胞表面标志CD29，CD44，CD73，CD90，CD105表达量无变化，阴性表达的表面标志CD31，CD45表达量降低，HLA-DR表达量增加;PCR结果显示c-kit与Sca-1的表达量均表达，无差异;MTT法检测细胞增殖速率，40%CM组MTT吸光值显著高于ADSC组（P=0.012成骨分化晚期表达的基因，诱导14d的ADSC组和ES组OPN及RUNX-2的表达量显著高于CM组。结论：1.胚胎干细胞条件培养液（ESC-CM）能够显著的提高hADSC的增殖速率。并不影响hADSC的细胞性质。2.胚胎干细胞条件培养液（ESC-CM）能够增加nanog，OCT-4的基因的表达量，增加了hADSC的多能性，并且能够抑制hADSC的凋亡。3.在成骨成脂诱导分化中，成骨早期

关键词：脂肪干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞条件培养液促细胞增殖成骨成脂分化

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Hedgehog信号通路在激素性股骨头坏死作用机制中的研究进展

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风湿病与关节炎 2023年第12期12卷 62-67,77页

作者：胡康一曹林忠尚征亚杨小瑞万超超张勇杰甘肃中医药大学甘肃兰州730000 甘肃中医药大学附属医院甘肃兰州730099

糖皮质激素的不正确使用导致股骨头内骨代谢异常、脂代谢失衡、血微循环障碍是激素性股骨头坏死发生、发展的重要原因之一。Hedgehog通路作为一条高保守信号通路,在组织器官骨骼的形成发育以及疾病过程中有着重要调控作用。近年来,随着... 详细信息

糖皮质激素的不正确使用导致股骨头内骨代谢异常、脂代谢失衡、血微循环障碍是激素性股骨头坏死发生、发展的重要原因之一。Hedgehog通路作为一条高保守信号通路,在组织器官骨骼的形成发育以及疾病过程中有着重要调控作用。近年来,随着精准医学的进一步发展以及对于细胞和分子生物学的广泛深入研究,发现Hedgehog信号通路可以通过促进骨髓间充质干细胞成骨分化,抑制脂肪细胞的生成,加速血管内皮细胞的新生对激素性股骨头坏死进行有效的靶向调控。现以Hedgehog信号通路在激素性股骨头坏死病理机制中发挥的调控作用进行综述,以期为临床治疗激素性股骨头坏死提供精确的靶点。

关键词：激素性股骨头坏死 Hedgehog信号通路骨髓间充质干细胞成骨成脂分化血管内皮细胞研究进展综述

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