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miR-486-3p调控CyclinD1在氟致成骨细胞增殖活化中的作用研究

miR-486-3p调控CyclinD1在氟致成骨细胞增殖活化中的作用研究

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作者：欧阳婷贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:氟诱导的成骨细胞异常增殖和活化与氟骨症息息相关,但其机制尚未完全阐明。MicroRNAs(miRNAs)作为重要的表观遗传调控因子,参与骨代谢及细胞周期的调控。本研究在既往发现CyclinD1高表达参与氟暴露成骨细胞增殖活跃基础上,结合课... 详细信息

目的:氟诱导的成骨细胞异常增殖和活化与氟骨症息息相关,但其机制尚未完全阐明。MicroRNAs(miRNAs)作为重要的表观遗传调控因子,参与骨代谢及细胞周期的调控。本研究在既往发现CyclinD1高表达参与氟暴露成骨细胞增殖活跃基础上,结合课题组前期miRNA测序结果,进一步探讨miR-486-3p对CyclinD1的调控机制及其在氟诱导的成骨细胞增殖活化中的作用,为miRNA在氟骨症防治中的应用提供新思路。方法:1.miR-486-3p与CyclinD1、TGF-β1在燃煤污染型氟暴露人群的表达及相关性分析:依据地方性氟中毒病区划分标准(GB 17018-2011),在贵州省燃煤污染型氟中毒病区毕节市织金县荷花村及非氟中毒地区安顺市双堡镇张官村选择调查对象。依据调查对象纳入、排除标准,追踪既往调查对象共248例,知情同意原则下取其血样及尿样,课题组前期通过氟离子选择电极法测定调查人群体内氟负荷并进行分组,根据测定的尿氟浓度(UF),将调查对象分为三组:(1)UF3.92 mg/g Cr,66例。使用miRWalk3.0数据库的四种不同算法(miRDB、miRWalk、Target Scan和miRTar Base)预测靶向CyclinD1的miRNA,结合课题组前期的miRNA-seq结果和筛选标准,预测出氟暴露人群中表达下调且靶向调控CyclinD1的miRNAs,包括miR-4755-5p,let-7c-5p和miR-486-3p。生物信息学分析显示miR-486-3p还靶向TGF-β1/Smad通路中的TGF-β1,本论文选择miR-486-3p进一步研究。在课题组前期检测血清中碱性磷酸酶活性(ALP)和骨钙素(BGP)含量、外周血单个核细胞(PBMCs)中CyclinD1表达的基础上。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证调查对象血浆中miR-486-3p表达;qRT-PCR、ELISA法检测PBMCs中TGF-β1mRNA转录及血浆中TGF-β1蛋白表达;Spearman相关性分析评估外周血中miR-486-3p和CyclinD1、TGF-β1之间的相关性。2.氟对miR-486-3p、CyclinD1、TGF-β1/Smad2/3/CyclinD1轴的影响:酶消法分离人原代成骨细胞,通过形态学观察、碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定人原代成骨细胞。根据课题组前期实验及预实验结果以0、600、1200μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h进行后续试验。qRT-PCR检测miR-486-3p、CyclinD1及TGF-β1 mRNA转录;免疫印迹法(Western blotting)检测CyclinD1、TGF-β1表达和核内外Smad2/3表达及磷酸化水平;细胞免疫荧光检测Smad2/3入核情况;染色质免疫共沉淀法(ChIP)法检测Smad2/3在CyclinD1转录调控区富集情况。3.miR-486-3p调控CyclinD1参与氟诱导的人成骨细胞增殖活化机制研究:(1)miR-486-3p参与氟诱导的人成骨细胞增殖活化:在课题组前期证实氟诱导人原代成骨细胞增殖活化的基础上,采用miR-486-3p mimic转染人成骨细胞24 h后进一步用1200μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h。qRT-PCR检测miR-486-3p表达;使用CCK-8、Ed U、流式细胞术、ALP活性和BGP含量检测miR-486-3p对成骨细胞增殖活化的影响。(2)miR-486-3p可直接靶向CyclinD1在转录后水平调控氟诱导的CyclinD1的上调。miR-486-3p mimic转染人成骨细胞24 h后,使用1200μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h,qRT-PCR检测CyclinD1 mRNA转录,Western blotting检测CyclinD1蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-486-3p与CyclinD1的靶标关系。(3)miR-486-3p可通过TGF-β1/Smad2/3通路在转录水平调控氟诱导的CyclinD1的上调。双荧光素酶报告基因实验验证miR-486-3p与TGF-β1的靶标关系。采用miR-486-3p mimic转染人成骨细胞24 h后进一步采用1200μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h,qRT-PCR检测TGF-β1 mRNA转录,Western blotting检测TGF-β1蛋白表达、核内外Smad2/3表达及磷酸化水平,细胞免疫荧光检测Smad2/3入核情况,以及ChIP检测Smad2/3在CyclinD1转录调控区富集情况。4.248例调查对象CyclinD1表达与相关miRNAs的多重线性回归分析:在248例调查对象中,分别以Cyc

关键词： miR-486-3p CyclinD1 TGF-β1/Smad2/3信号通路氟骨症成骨增殖与活化

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