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N-Ac-L-Leu-PEI搭载miR-34a促进大鼠BMSCs成骨向分化作用

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N-Ac-L-Leu-PEI搭载miR-34a促进大鼠BMSCs成骨向分化作用

作者：李洋洋吉林大学

学位级别：硕士

牙周炎是一种慢性非特异性感染性疾病,主要由于菌斑生物膜入侵牙周组织,诱发宿主产生免疫应答而发生的免疫炎症反应,随病程进展,软硬组织遭到破坏,早期表现为牙周软组织炎症和牙槽骨吸收,晚期则出现牙齿松动脱落。据报道美国成年人牙周... 详细信息

牙周炎是一种慢性非特异性感染性疾病,主要由于菌斑生物膜入侵牙周组织,诱发宿主产生免疫应答而发生的免疫炎症反应,随病程进展,软硬组织遭到破坏,早期表现为牙周软组织炎症和牙槽骨吸收,晚期则出现牙齿松动脱落。据报道美国成年人牙周炎患病率达到47%,在我国,成年人牙周炎患病率高达80%以上,很明显,牙周炎已经成为威胁人类健康的一种常见病、多发病。牙齿缺失不但影响口腔健康,也与全身健康息息相关,研究已经证实,牙周炎与高血压、糖尿病、心血管疾病、慢性阻塞性肺炎、老年痴呆、早产儿及低出生体重儿等都存在很大相关性,尤其是糖尿病,目前已经确定牙周炎是糖尿病的第六大并发症。因此研究炎症导致的牙槽骨吸收机制,抑制炎性牙槽骨吸收、加强骨改建、促进骨再生对人类的口腔健康甚至全身健康具有重大意义。近年,微小RNA对成骨细胞及破骨细胞调控作用成为研究热点。其中微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)不但在细胞增殖、周期、凋亡等生理或病理过程中起到调节作用,在骨改建方面,国内外多项实验结果表明miR-34a可抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症应答,抑制破骨细胞形成进而减少骨吸收,另外,miR-34a可促进人骨髓间充质干细胞及脂肪干细胞成骨分化。基于miR-34a可促进多种类型干细胞成骨向分化,但因本身带有负电荷、亲水性、易降解性而限制其向宿主细胞膜的穿透。本实验拟运用N-Ac-L-Leu修饰的PEI衍生物(N-Ac-L-Leu-PEI)作为miR-34a新型传递介质,构建靶向性强、生物相容性好的N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a纳米复合物,探究N-Ac-L-Leu-PEI搭载的miR-34a在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨向分化方面发挥的作用,为未来基因治疗牙槽骨吸收奠定一定实验基础。方法:不同质量比N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物与BMSCs共孵育,运用流式细胞术检测BMSCs细胞内复合物的转染效率,MTT法检测细胞增殖,筛选得到N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物对于BMSCs细胞内最佳转染质量比;以最佳质量比N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a刺激BMSCs,利用碱性磷酸酶试剂盒(ALP)测定细胞内ALP活力,实时定量PCR检测细胞内成骨标志性RUNX2、SP7、ColⅠ的mRNA表达。结果:质量比4:1的N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物对BMSCs增殖较其他实验组影响较弱前提下,细胞内转染效率相对高。同时,该质量比复合物可促进BMSCs细胞内碱性磷酸酶释放。尽管与空白对照组相比,该复合物对成骨标志性基因表达的影响不一致,但同N-Ac-L-Leu-PEI组相比较,质量比4:1的N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物均可上调成骨标志性基因RUNX2、SP7、ColⅠ的mRNA表达。结论:1.在对BMSCs细胞增殖影响相对较弱前提下,N-Ac-L-Leu-PEI与miR-34a最佳转染质量比为4:1。2.N-Ac-L-Leu-PEI可作为miR-34a有效载体,协助mi R-34a发挥促进BMSCs成骨向分化作用。

关键词：微小RNA-34a 骨髓间充质干细胞增殖碱性磷酸酶成骨向分化

雷帕霉素靶蛋白复合物2在微/纳米分级形貌调控细胞成骨向分化中的作用及机制探究

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雷帕霉素靶蛋白复合物2在微/纳米分级形貌调控细胞成骨向分化中的...

作者：高倩天津医科大学

学位级别：硕士

目的:种植体表面形貌作为一种机械信号,在种植体周围细胞命运调控过程中发挥关键作用。诸多研究表明,较单一的微米或者纳米级形貌而言,微/纳米分级形貌具有更强的促进种植材料表面新骨形成的能力,但其调控细胞成骨向分化的机制尚不完全... 详细信息

目的:种植体表面形貌作为一种机械信号,在种植体周围细胞命运调控过程中发挥关键作用。诸多研究表明,较单一的微米或者纳米级形貌而言,微/纳米分级形貌具有更强的促进种植材料表面新骨形成的能力,但其调控细胞成骨向分化的机制尚不完全明确,而对此问题的深入探索将有助于对材料表面进行改良以定向调控细胞命运。近年来,诸多研究证实雷帕霉素靶蛋白复合物2（The mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2）能够响应机械因素,参与调控细胞的成骨成脂向分化,提示其可能在微/纳米分级形貌表面调控细胞命运中的过程中发挥一定作用。本研究即旨在探究mTORC2在微/纳米分级形貌促进细胞成骨向分化中的作用及内在分子机制,进一步完善种植材料表面形貌调控细胞命运的分子调控网络研究,为特异性调控细胞命运的材料表面设计提供理论依据。方法:1.通过选择性激光熔融技术（Selective Laser Melting,SLM）结合碱热处理（Alkai Heat Treatment,AHT）制备具有微/纳米分级形貌的钛表面（SLM-AHT）作为实验组,同时制备光滑钛表面（S）和具有单一微米级形貌的喷砂酸蚀钛表面（SLA）作为对照组进行实验。将野生型前成骨细胞系MC3T3-E1细胞接种于三种钛表面培养24小时后检测细胞黏附状态:通过免疫荧光实验观察细胞黏着斑的数量及细胞骨架聚集情况、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测细胞黏附相关分子黏着斑蛋白（vinculin）的mRNA表达水平、免疫印迹实验（western blot）检测vinculin、黏着斑激酶（FAK）、磷酸化的黏着斑激酶（p-FAK）的蛋白表达水平;将野生型MC3T3-E1细胞接种于三种钛表面培养3天与7天检测细胞成骨向分化能力:RT-qPCR检测成骨向分化标志物Runt相关转录因子2（Runx2）和Osteocalcin（Ocn）的mRNA表达量、western blot检测RUNX2蛋白表达量、免疫荧光检测不同钛表面细胞RUNX2阳性染色比例。2.探究mTORC2在微/纳米分级形貌促进细胞成骨向分化过程中的作用。将野生型MC3T3-E1细胞接种于三种钛表面24小时及3天后,通过RT-qPCR检测mTORC2信号通路分子关键分子Rictor的mRNA表达水平,western blot检测mTORC2信号通路分子关键分子m TOR、Rictor、AKT、p-AKT的蛋白表达水平;通过构慢病毒包装构建Rictor稳定敲低的MC3T3-E1细胞,将对照组细胞与Rictor稳定敲低的MC3T3-E1细胞同时接种于三种钛表面,RT-qPCR检测成骨向分化标志物Runx2、Ocn的mRNA表达量,western blot检测RUNX2蛋白表达量;免疫荧光检测培养在三种钛表面细胞RUNX2阳性染色比例。3.探究mTORC2调控微/纳米分级形貌促进细胞成骨向分化的分子机制。将对照组细胞与Rictor稳定敲低的MC3T3-E1细胞接种于三种钛表面24小时及3天后,通过免疫荧光实验观察三种钛表面细胞Rictor的定位情况、免疫共沉淀（Immunoprecipitation,IP）检测vinculin与Rictor是否存在互相作用、western blot检测培养在三种钛表面对照组细胞及Rictor稳定敲低MC3T3-E1细胞的黏附相关分子vinculin、FAK、p-FAK的表达、免疫荧光检测对照组细胞及Rictor稳定敲低MC3T3-E1细胞在三种钛表面培养后细胞骨架的状态变化。结果:1.场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）显示SLM-AHT钛表面呈现出均匀的微米沟槽（约30-40μm）和纳米网孔（直径约为100nm）复合结构,证明本研究成功制备了具有微米沟槽/纳米网孔的分级形貌SLM-AHT钛表面;光滑钛表面可见砂纸抛光的划痕;SLA表面呈现典型的微米级结构,不存在纳米级结构。免疫荧光结果显示,接种在三种钛表面的MC3T3-E1细胞在培养24小时后,与S、SLA表面相比,SLM-AHT表面所培养的细胞成熟黏着斑所占比例最大且细胞骨架聚集程度明显增强,western blot结果显示SLM-AHT表面黏附相关分子p-FAK蛋白表达量明显增多;RT-qPCR、western blot结果显示SLM-AHT表面成骨向分化标志物RUNX2、OCN的表达量均增高。上述结果证实SLM-AHT表面具有更强的促进细胞黏附、促进细胞骨架重组以及促进细胞成骨向分化的能力。***-qPCR、western blot显示,SLM-AHT表面mTORC2信号通路分子Rictor、p-AKT的表达量明显上调,证明微/纳米分级形貌能够激活mTORC2信号通路。Rictor稳定敲低的MC3T3-E

关键词：微/纳米分级结构雷帕霉素靶蛋白复合物2 细胞黏附细胞骨架成骨向分化

N-Ac-L-Leu-PEI介导miR-34a复合物对MG63细胞生物学性能及成骨向分化的影响

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N-Ac-L-Leu-PEI介导miR-34a复合物对MG63细胞生物学性能及成骨向...

作者：刘引吉林大学

学位级别：硕士

目的:通过N-Ac-L-Leu-PEI介导miR-34a转染MG63细胞,检测N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物表征,N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物对MG63生物学性能的影响,N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物对MG63成骨向分化的影响。方法:首先,为筛选出N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a最佳转染质量比,以N-Ac-L-Leu-PEI为载体按不同质量比静电装载miR-34a形成N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物。采用马尔文粒度电位仪检测N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物粒径、电位;琼脂糖凝胶电泳检测N-Ac-L-Leu-PEI装载miR-34a能力;应用荧光成像、流式细胞术及RT-PCR技术检测复合物对MG63细胞转染效率及miR-34a基因表达情况,筛选最佳转染质量比;其次,为评价N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a对MG63细胞生物学性能的影响,采用MTT检测复合物对MG63细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测复合物对MG63细胞周期、凋亡的影响;最后,通过RT-PCR技术及Western blot技术检测复合物对MG63细胞内成骨相关因子在基因及蛋白表达水平的改变,探讨N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a对成骨细胞成骨向分化的调控。N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物随质量比增加,粒径呈减小趋势,电位呈增大趋势,且质量比≥2:1时,miR-34a被N-Ac-L-Leu-PEI完全装载,形成稳定复合物。当质量比为4:1时,N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物在MG63细胞中转染效率最高。与空白对照组比较,N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a复合物抑制细胞增殖,抑制细胞周期,对细胞凋亡无明显影响。RT-PCR和Western blot分析,与空白对照组比较,N-Ac-L-Leu-PEI/miR-34a组促进Runx2、SP7和ColⅠ成骨基因表达。结果:结论:以N-Ac-L-Leu-PEI作为载体可使miR-34a有效转染至MG63细胞并在细胞中高表达,miR-34a具有一定的抑制MG63细胞增殖、促进MG63细胞成骨向分化的作用。

关键词： miR-34a N-Ac-L-Leu-PEI 成骨细胞成骨向分化

分级微纳复合形貌通过Integrin α2-PI3K-AKT信号轴促进细胞粘附和成骨向分化

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分级微纳复合形貌通过Integrin α2-PI3K-AKT信号轴促进细胞粘附...

作者：郑慧敏天津医科大学

学位级别：硕士

目的:生命体中的细胞存在于具有不同形貌结构特征的空间环境中,空间形貌特征通过力学信息传递生物信号,介导细胞功能选择,参与生命体发生发展。因此,探究形貌结构特征对细胞命运调控的内在机理具有重要意义。天然骨组织是多级有序的疏... 详细信息

目的:生命体中的细胞存在于具有不同形貌结构特征的空间环境中,空间形貌特征通过力学信息传递生物信号,介导细胞功能选择,参与生命体发生发展。因此,探究形貌结构特征对细胞命运调控的内在机理具有重要意义。天然骨组织是多级有序的疏松多孔结构,模仿天然骨组织构建的种植体具有微纳复合形貌,在介导细胞粘附和成骨向分化过程中具有潜在优势,但其作用机制尚不清晰。因此解析分级微纳复合形貌-细胞间相互作用及内在机理具有重要而迫切的生物学意义。本研究采用选择性激光熔融结合碱热处理(selective laser melting combining with alkali heat treatment,SLM-AHT)工艺设计制备了具有分级微纳复合形貌的钛表面,以期探究SLM-AHT钛表面分级微纳复合形貌在介导细胞粘附和成骨向分化过程中的作用及内在机理。方法:1.采用机械抛光、喷砂酸蚀、选择性激光熔融结合碱热处理工艺设计制备光滑钛表面(S)、喷砂酸蚀钛表面(SLA)和激光熔融结合碱热处理钛表面(SLMAHT)。对三组钛表面进行表面形貌观测。通过场发射扫描电镜(FE-SEM)观察在不同放大率下三组钛表面的形貌特征。使用Image J软件分析SLM-AHT表面纳米孔孔径分布情况。2.将细胞在三组钛表面培养特定时间后,分开检测不同组别钛表面细胞的形态伸展、增殖与迁移情况。通过FE-SEM和激光共聚焦显微镜(CLSM)观察三组钛表面细胞形态伸展;免疫荧光(Immunofluorescence)染色后检测细胞核数量,总结细胞在三组钛表面增殖情况;细胞划痕实验检测细胞在三组钛表面迁移速度。3.通过体外细胞实验检测不同组别钛表面形貌对细胞粘附的影响。对粘着斑核心蛋白纽蛋白(Vinculin)进行染色,通过共聚焦显微镜观察、Image J软件分析检测不同形貌钛表面粘着斑的数量和大小。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测粘附相关基因整联蛋白α2(Integrinα2)和Vinculin表达水平。蛋白质印迹法(Western Blot)检测粘附相关基因Integrinα2、Vinculin、FAK和p-FAK的蛋白表达水平。4.检测成骨诱导后不同表面形貌对细胞成骨向分化的影响。分别用qRTPCR和Western Blot检测不同组别钛表面成骨相关基因Runx2,Col1a1和Ocn的表达水平。免疫荧光染色检测细胞核内成骨基因Runx2的阳性水平。5.探究Integrinα2-PI3K-AKT信号轴在分级微纳复合形貌介导细胞成骨向分化中的功能。通过qRT-PCR和Western Blot检测成骨诱导后不同形貌钛表面Integrinα2的表达水平。随后,敲低Integrinα2,通过qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光检测成骨相关基因的表达来验证Integrinα2对细胞成骨向分化的影响。同时,通过Western Blot检测不同形貌钛表面PI3K-AKT信号通路相关因子的蛋白表达水平。验证不同表面形貌对PI3K-AKT信号通路的影响。最后,构建Integrinα2过表达细胞,通过Western Blot检测PI3K-AKT信号通路相关因子的蛋白表达水平,并通过qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光检测成骨相关基因的表达。验证Integrinα2-PI3K-AKT信号轴在分级微纳复合形貌介导细胞成骨向分化中的功能。结果:1.通过机械抛光、喷砂酸蚀、激光熔融结合碱热处理工艺成功制备了三组具有不同形貌特征的钛表面。FE-SEM结果分析显示SLM-AHT钛表面具有微纳复合形貌。Image J软件分析显示SLM-AHT钛表面纳米孔孔径分布均匀,其中直径为40nm的纳米孔最多。***-SEM和CLSM结果显示,SLM-AHT钛表面分级微纳复合形貌更有助于细胞早期伸展;免疫荧光染色后通过细胞核计数显示,相比于S和SLA表面,SLM-AHT钛表面分级微纳复合形貌更有利于细胞的增殖;细胞划痕实验证明,相比于S和SLA表面,SLM-AHT钛表面分级微纳复合形貌更能促进细胞的迁移。3.对粘着斑的数量和大小进行观察分析,结果表明SLM-AHT钛表面分级微纳复合形貌更有利于成熟粘着斑的形成。qRT-PCR和Western Blot实验结果表明,相比于S和SLA表面,SLM-AHT钛表面分级微纳复合形貌更能促进细胞粘附。***-PCR、Western Blot和免疫荧光结果表明,相比于S和SLA表面,SLM-AHT分级微纳复合形貌钛表面更有利于细胞成骨向分化。***-PCR和Western Blot实验结果表明,相比于S和SLA表面,Integrinα2在SLM-AHT分级微纳复合形貌钛表面有更高水平的表达。敲低Integrinα2后,细胞成骨基因表达水平均降低,

关键词：分级微纳复合形貌粘附成骨向分化粘着斑 Integrin α2 PI3K-AKT

BMP-2与TGF-β3对DPSCs成骨向分化的对比研究

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BMP-2与TGF-β3对DPSCs成骨向分化的对比研究

作者：李鹏新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:对比研究转化生长因子-β3(Transforming growth factor-β3,TGF-β3)与骨形成蛋白-2(Bone morphogenic protein-2,BMP-2)分别对牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)成骨向分化潜能的影响。方法:健康新西兰幼兔4只,取牙髓组织采用酶解组织块法分离培养获得DPSCs,镜下观察细胞形态及生长状况。将培养的第3代DPSCs分为BMP-2组和TGF-β3组,分别加入浓度为80 ug/L的BMP-2、TGF-β3的完全培养液,采用免疫组织化学法于诱导第3、7天检测Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)表达,于第7、14天检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)表达,应用IPP图像分析软件测量累计吸光度(Integrated optical density,IOD)值;诱导第7、14天,对BMP-2组、TGF-β3组进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色后,倒置显微镜下观察ALP活性染色结果。结果:兔DPSCs分离、培养约48 h,组织块周围有细胞游出、贴壁生长,培养的兔DPSCs大多为长梭形,也可为多角形,呈巢式或集落生长;TGF-β3组诱导第3天COL-1表达的IOD值(159676.799±63959.568)高于BMP-2组(44047.330±15853.656)(P0.05);TGF-β3组诱导第7天OC表达的IOD值(109568.817±14079.885)高于BMP-2组(55168.568±1694.930)(P0.05);BMP-2组、TGF-β3组诱导第7天出现少量淡蓝色的ALP阳性区,诱导第14天蓝色ALP阳性区增大且蓝染颜色加重,镜下观察2组无明显差异。结论:与BMP-2比较,TGF-β3对早期兔DPSCs向成骨细胞分化有较明显的促进作用。

关键词：牙髓干细胞转化生长因子-β3 骨形成蛋白-2 成骨向分化

自体浓缩生长因子对比格犬脂肪干细胞体外增殖及成骨向分化的初步研究

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自体浓缩生长因子对比格犬脂肪干细胞体外增殖及成骨向分化的初步...

作者：马翔宇重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:自体浓缩生长因子(CGF)是继富血小板血浆(PRP)及富血小板纤维蛋白(PRF)之后的第3代自体血液提取物。相比于PRP及PRF,其内部含有的纤维蛋白或生长因子聚合度及含量更高,具有更强的促进组织再生能力。脂肪干细胞(ADSCs)是自脂肪组织... 详细信息

目的:自体浓缩生长因子(CGF)是继富血小板血浆(PRP)及富血小板纤维蛋白(PRF)之后的第3代自体血液提取物。相比于PRP及PRF,其内部含有的纤维蛋白或生长因子聚合度及含量更高,具有更强的促进组织再生能力。脂肪干细胞(ADSCs)是自脂肪组织中分离获取的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞,与其它来源的干细胞相比,ADSCs具有储备充足、制备简便、再生性强等诸多优点,逐渐成为组织工程学重要的种子细胞。本实验以比格犬脂肪干细胞作为研究对象,观察CGF对比格犬脂肪干细胞体外增殖及成骨向分化的影响,探讨两者联合应用于骨再生的可行性。方法:1.比格犬脂肪干细胞的分离培养选取健康的12月龄雄性比格犬,体重10～12kg,在无菌条件下制取单侧腹股沟部脂肪组织,通过酶消化法及贴壁法对比格犬脂肪干细胞进行分离、培养,收集第3代细胞用于后续实验。2.比格犬脂肪干细胞的多向分化能力鉴定脂肪干细胞贴壁后将普通培养基分别更换为成骨培养基、成脂培养基及成软骨培养基进行诱导,诱导21d后弃培养液并固定,成骨组行茜素红染色,成脂组行油红O染色,成软骨组行阿利新蓝染色。***的制备及实验分组取比格犬前肢头静脉血10mL于负压离心管内,放入Medifuge CGF离心机中,配平后按程序制备CGF,剪碎后加入条件培养基。细胞按普通培养基中是否加入CGF,分为普通培养基+CGF组(CGF组)和普通培养基组(对照组)。4.应用CCK-8法检测CGF对比格犬脂肪干细胞增殖能力的影响。5.应用碱性磷酸酶染色法检测CGF对经成骨诱导的脂肪干细胞的碱性磷酸酶活性的影响。6.应用RT-PCR法检测经成骨诱导的脂肪干细胞的I-型胶原、骨钙蛋白、RUNX-2、骨桥蛋白等成骨相关基因的表达水平。7.统计学处理所有数据采用SPSS 22.0软件进行分析,组间比较采用独立样本t检验,P成骨诱导21d后行茜素红染色,镜下见大量红色矿化颗粒形成,部分区域钙结节相互融合成片状。成脂诱导21d后行油红O染色,镜下见细胞体积增大,胞质内见亮红色脂类油滴。成软骨诱导21d后行阿利新蓝染色,镜下细胞内可见蓝色胞浆。***-8法结果示:两组脂肪干细胞增殖活力正常,生长曲线均呈“S”形,第3-7天CGF组细胞增殖趋势明显高于对照组。4.碱性磷酸酶染色结果示:经成骨诱导7d后,镜下见胞质及细胞外基质均可观察到紫蓝色矿化颗粒,但无论大体还是镜下(×40、×100)观察,CGF组染色深度及矿化颗粒密度均明显大于对照组。***-PCR结果示:经成骨诱导4d后CGF组细胞ALP、OCN、OPN、Runx2的mRNA水平略高于对照组,组间差异无统计学意义(P>0.05);但经成骨诱导7d后,CGF组ALP、Col-I、OCN、OPN及Runx2的mRNA水平均明显高于对照组(P向分化能力,验证了制取细胞为间充质干细胞。***能显著增强比格犬脂肪干细胞体外增殖能力。***能加强成骨培养基诱导效应,能够有效促进脂肪干细胞成骨向分化。

关键词：浓缩生长因子脂肪干细胞增殖成骨向分化

转化生长因子β3促进兔牙髓干细胞成骨向分化机制的初步研究

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口腔医学 2019年第2期39卷 97-102页

作者：艾力麦尔旦.艾尼瓦尔木合塔尔.霍加新疆维吾尔自治区人民医院口腔科新疆乌鲁木齐830001 深圳市罗湖区人民医院口腔科广东深圳518001

目的探讨转化生长因子β3(transforming growth factorβ3,TGF-β3)体外联合兔牙髓干细胞(rabbit dental pulp stem cells,r DPSCs)诱导其成骨向分化的作用机制。方法酶解组织块法分离获得r DPSCs;将r DPSCs分为实验组(r DPSCs+80μg/L TGF-β3)、对照组(r DPSCs+矿化液)和空白组(r DPSCs),3组细胞分别培养7、14 d后行ALP活性定量检测; RT-qPCR检测COL-1A1、Runx-2、OPN、BSP和Smad4基因的表达; Western blot法检测COL-1A1和Runx-2蛋白的表达情况;茜素红染色观察矿化结节形成情况。结果成功分离获得r DPSCs;实验组ALP含量明显高于对照组和空白组(P成骨向分化; TGF-β3促进r DPSCs成骨向分化可能通过激活Smad通路来实现。

关键词：转化生长因子β3 兔牙髓干细胞成骨向分化 Smad通路

果蝇裸露角蛋白2对大鼠牙囊细胞成骨向分化的调控机制研究

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口腔颌面修复学杂志 2018年第4期19卷 246-252页

作者：陈婵婵凌均棨丁桂聪廖志清中山大学光华口腔医学院附属口腔医院博士生广东510055 深圳市儿童医院口腔科主治医师广东518026 中山大学光华口腔医学院附属口腔医院口腔医学研究所主任医师广东510055

目的:研究体外果蝇裸露角蛋白2(naked cuticle homolog 2,Nkd2)对大鼠牙囊细胞(rat dental follicle cells,rDFCs)成骨向分化的调控机制。方法:体外培养rDFCs,鉴定其组织来源并进行成骨向分化诱导,茜素红染色验证其成骨向分化能力,激光... 详细信息

目的:研究体外果蝇裸露角蛋白2(naked cuticle homolog 2,Nkd2)对大鼠牙囊细胞(rat dental follicle cells,rDFCs)成骨向分化的调控机制。方法:体外培养rDFCs,鉴定其组织来源并进行成骨向分化诱导,茜素红染色验证其成骨向分化能力,激光共聚焦检测检测Nkd2在中rDFCs的表达;采用小RNA干扰技术,干扰rDFCs中的Nkd2表达后进行成骨向分化诱导,western blot检测小RNA干扰对rDFCs表达成骨向分化因子Runx2、Col-1和OCN的影响;免疫荧光染色检测β-catenin在rDFCs中的分布变化,western blot检测小RNA干扰对rDFCs表达蓬乱蛋白1(Dishevelled-1,Dvl-1)的表达变化和Wnt/β-catenin信号通路激活剂Wnt3a与阻断剂FH535处理rDFCs后Nkd2的表达改变。结果:获得体外培养的rDFCs,并成功诱导其成骨向分化,茜素红染色显示矿化结节形成。Nkd2在rDFCs中的表达主要分布于胞浆和胞核周围。Nkd2小RNA干扰后的rDFCs中Runx2、Col-1蛋白表达明显下调,Dvl-1的表达下调。同时,Wnt3a处理组rDFCs中Nkd2蛋白表达量升高,而FH535处理组的表达量下降。结论:Nkd2通过Dvl-1调控Wnt/β-catenin信号通路促进rDFCs的成骨向分化;Nkd2是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因,对Wnt/β-catenin信号通路起正反馈调节作用。

关键词： Nkd2 牙囊细胞成骨向分化 Wnt/β-catenin信号通路

葛根素通过Wnt/β-catenin信号通路对牙髓干细胞的增殖及成骨向分化的作用机制研究

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口腔颌面修复学杂志 2023年第1期24卷 13-19页

作者：杨盼盼马鹏涛郑蕾郑州大学附属儿童医院河南省儿童医院郑州儿童医院口腔科郑州450000

目的:探讨葛根素对牙髓干细胞体外增殖及成骨向分化的影响及其可能作用机制。方法:分离人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)并培养鉴定,使用不含葛根素及含不同浓度葛根素(0.01、0.1、1、10μmol/L)的培养液干预,CCK-8... 详细信息

目的:探讨葛根素对牙髓干细胞体外增殖及成骨向分化的影响及其可能作用机制。方法:分离人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)并培养鉴定,使用不含葛根素及含不同浓度葛根素(0.01、0.1、1、10μmol/L)的培养液干预,CCK-8法检测细胞增殖情况,筛选出最佳作用浓度;将细胞分为阴性对照组、阳性对照组及实验组,茜素红染色观察并分析各组h DPSCs矿化沉积情况,比色分析法检测各组细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性以评估葛根素对h DPSCs成骨向分化的影响;免疫荧光染色检测β-catenin细胞内表达情况;Western blot技术检测通路相关蛋白和细胞周期素D1(Cyclin D1)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的蛋白表达水平。结果:经成骨化诱导及成脂化诱导检测,体外分离并培养、传代细胞为h DPSCs,具有成骨向分化潜能,可用于后续试验;CCK8检测结果显示,与不含葛根素组比较,0.01、0.1、1、10μmol/L葛根素组细胞吸光度值均升高,且1μmol/L葛根素作用下的细胞吸光度值最高(P成骨向分化,其作用发挥机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

关键词：葛根素牙髓干细胞增殖成骨向分化 Wnt/β-catenin信号通路