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非黏附骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定

实用儿科临床杂志 2008年第7期23卷 534-536页

作者：王燕陈燕玲贲晓明喻文亮周晓玉苗登顺南京医科大学附属南京儿童医院新生儿医疗中心南京210008

目的探讨小鼠骨髓中是否存在非黏附间充质干细胞(BM-NA-MSC),体外能否形成成纤维细胞集落形成单位(CFU-F),能否在适当的条件下分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。方法分离小鼠总骨髓细胞,体外培养,每天转移未贴壁的非黏附骨髓细胞(NA... 详细信息

目的探讨小鼠骨髓中是否存在非黏附间充质干细胞(BM-NA-MSC),体外能否形成成纤维细胞集落形成单位(CFU-F),能否在适当的条件下分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。方法分离小鼠总骨髓细胞,体外培养,每天转移未贴壁的非黏附骨髓细胞(NA-BMC)到新培养环境中继续培养,每组细胞长满12 d后,亚甲基蓝染色显示形成的克隆,计数克隆个数;在总骨髓细胞培养到第4天时收集未贴壁的NA-BMC到新的培养皿中,待细胞贴壁生长达融合后传代纯化,取第5代细胞接种于向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞诱导分化的培养液中,2周后分别进行油红染色、抗Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色及茜素红染色检测脂肪滴、Ⅱ型胶原和钙化结节的形成和表达。结果小鼠骨髓细胞体外培养条件下不仅总骨髓细胞可以形成CFU-F,而且反复转移的NA-BMC也能不断形成CFU-F;给予适当的诱导条件,非黏附来源的骨髓细胞体外能够分化为产生油滴的脂肪细胞、表达Ⅱ型胶原的软骨和具有钙化能力的成骨细胞。结论小鼠骨髓中存在一类NA-MSC,体外可以形成CFU-F,还可分化为脂肪、软骨和成骨细胞,表现出一定的多分化潜能,为下一步作为种子细胞用于移植实验的研究提供了前提。

关键词：间充质干细胞,非黏附,骨髓成纤维细胞集落形成单位多分化潜能

1，25-(OH)2D3在促进大鼠外周血间充质干细胞扩增中的作用

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南京医科大学学报（自然科学版） 2009年第6期29卷 771-774页

作者：刘波任永信苗登顺曹晓建南京医科大学第一附属医院骨科江苏南京210029 南京医科大学骨与干细胞研究中心江苏南京210029

目的:探讨大鼠外周血中是否存在非黏附间充质干细胞(MSCs)以及1,25-(OH)2D3能否刺激它们形成成纤维细胞集落形成单位(CFU-f)。方法:从大鼠外周血中分离单核粒细胞(PBMGC)组份,在缺乏和添加10-8mol/L1,25-(OH)2D3条件下进行贴壁培养。培... 详细信息

目的:探讨大鼠外周血中是否存在非黏附间充质干细胞(MSCs)以及1,25-(OH)2D3能否刺激它们形成成纤维细胞集落形成单位(CFU-f)。方法:从大鼠外周血中分离单核粒细胞(PBMGC)组份,在缺乏和添加10-8mol/L1,25-(OH)2D3条件下进行贴壁培养。培养至4天和8天时,将未贴壁细胞转移到新的培养皿中继续培养,即:"pour-off"培养,培养16天形成的细胞进行亚甲基蓝染色,计数CFU-f数目,并对4天"pour-off"培养形成的细胞进行免疫细胞化学染色。结果:PBMGC培养及4天和8天非黏附PBMGC培养都能形成CFU-fs,而1,25-(OH)2D3能够明显地促进它们形成CFU-f。非黏附细胞形成的克隆表达波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅲ型胶原,而不表达Ⅰ型胶原。结论:大鼠外周血中存在非黏附MSCs,在体外培养能够形成CFU-fs,而1,25-(OH)2D3具有促进外周血MSC扩增的作用。

关键词：外周血间充质干细胞成纤维细胞集落形成单位 1,25-(OH)2D3

非黏附骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的实验研究

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非黏附骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的实验研究

作者：王燕南京医科大学

学位级别：硕士

干细胞移植是近年来医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点和前沿,其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能,并能在体内外表达多种外源目的基因,因而作为种子细胞被广泛用于细胞疗法和基因疗法的研究中。随着功能基因组学和蛋白质组... 详细信息

干细胞移植是近年来医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点和前沿,其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能,并能在体内外表达多种外源目的基因,因而作为种子细胞被广泛用于细胞疗法和基因疗法的研究中。随着功能基因组学和蛋白质组学的进一步发展,干细胞的基础以及临床应用研究也取得了突破性进展。骨髓来源的间充质干细胞是起步较早研究较深入的成体干细胞,长期以来人们一致认为它是骨髓中一类高度黏附的成纤维细胞样细胞,然而Miao等最近的实验结果显示:大鼠骨髓中存在一种非黏附状态的间充质干细胞,体外培养条件下能够贴壁生长形成克隆,给予以往用于骨髓间充质干细胞的诱导条件也可以分化为三种间质终末期细胞,注射到亚致死剂量射线照射的小鼠体内可以参与其造血重建,表现出一定的多分化潜能。本文将在此理论基础上通过反复转移的非黏附细胞培养法分离小鼠骨髓中的非黏附间充质干细胞;观察表皮生长因子对非黏附间充质干细胞克隆形成效率的调节作用;并深入探讨非黏附骨髓间充质干细胞在体外、体内尤其是缺血损伤的微环境中分化为神经细胞的潜能,为这些细胞进一步用于细胞移植治疗相关疾病提供技术参数。第一部分小鼠非黏附骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定以及表皮生长因子对其克隆形成效率的影响目的分离培养并鉴定小鼠骨髓中的非黏附间充质干细胞（Non-adherent Bone-Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,NA-BM-MSC）;观察表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）对NA-BM-MSC产生成纤维细胞集落形成单位（colony-formingunits-fibroblast,CFU-F）效率的影响。方法分离小鼠总骨髓细胞,分两组体外培养,一组在总骨髓细胞中加入10ng/mL的EGF,另一组为对照组,每天转移未贴壁的非黏附骨髓细胞（Non-adherent Bone MarrowCells,NA-BMC）到新的培养皿中继续培养,每组中各皿细胞长满12天后,亚甲基蓝染色显示形成的克隆,计数克隆个数;在总骨髓细胞培养到第四天时收集未贴壁的NA-BMC到新的培养皿中,待细胞贴壁生长达融合后传代纯化,取第四代细胞接种于向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞诱导分化的培养液中,2周后分别进行油红染色、抗Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色以及茜素红染色检测脂肪滴、Ⅱ型胶原和钙化结节的形成和表达情况;流式细胞检测表面标记物的表达。结果反复转移未贴壁NA-BMC到新培养皿继续培养的过程中,不仅总骨髓细胞可以贴壁形成CFU-F,而且反复转移的未贴壁NA-BMC也能不断贴壁并形成CFU-F;总骨髓细胞培养到第四天时收集的NA-BMC经脂肪细胞诱导液诱导后,油红染色可见细胞内产生大量油滴;经软骨细胞诱导液诱导后有软骨细胞特异性Ⅱ型胶原表达;经成骨细胞诱导液诱导后能够形成钙化结节;这些细胞高表达CD105、CD13,而不表达CD34、CD45等造血干细胞的特异性标记。加EGF刺激组每次转移的非黏附细胞贴壁生长后得到的细胞数和克隆数均比对照组多（P＜0.05）,是对照组的3倍。结论小鼠骨髓细胞培养过程中,24小时内未贴壁的NA-BMC转移到新培养皿中继续培养能够重新贴壁并形成CFU-F,并且NA-BMC所形成的克隆具有向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞分化的能力,具备了干细胞自我复制更新和多分化潜能的两大特性,并表达间充质细胞的特异性标记物,因此称其为非黏附骨髓间充质干细胞（NA-BM-MSC）。EGF能有效促进NA-BM-MSC的增殖,进一步提高了该细胞的富集效率。多分化潜能;表皮生长因子;增殖第二部分非黏附骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验研究目的探讨骨髓中存在的NA-BM-MSC在体外向神经细胞分化的能力。方法分离小鼠骨髓总细胞进行培养,于第四天收集未贴壁的NA-BMC到新的培养环境中继续培养,待细胞贴壁融合后传代纯化,取第四代细胞用于诱导实验;细胞按照1X10～3/cm的密度接种于预置盖玻片的六孔板中,细胞贴壁后,更换培养液为含20ng/ml的EGF和20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子-2（b-FGF）的诱导液进行诱导,2周后,甲苯胺蓝染色和抗神经细胞特异性核蛋白、抗神经中间丝蛋白的免疫细胞化学染色检测神经细胞特异性蛋白的表达。结果总骨髓细胞和NA-BM-MSC经过EGF和b-FGF的诱导后都能表达神经特异性蛋白:NeuN/NF-200/尼氏体。结论NA-BM-MSC在适当的条件下能够被诱导分化成神经细胞,为下一步用于体内实验的研究提供了保证。第三部分非黏附骨髓间充质干细胞在缺血损伤脑内向神经细胞分化的实验研究目的探讨骨髓非黏附间充质干细胞（non-adherent bonemorrow mesenchymal stem cells,NA-BM-MSC）在缺血损

关键词：非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成单位多分化潜能表皮生长因子增殖非黏附骨髓间充质干细胞诱导分化神经细胞非黏附骨髓间充质干细胞脑缺血移植分化神经元

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人腹膜中间充质干细胞生物学特性的初步研究

组织工程与重建外科杂志 2011年第3期7卷 133-135页

作者：吴黎敏林庆凡李航李黎洪张劲帆福建医科大学莆田学院附属医院教学医院肿瘤科福建省莆田市351100

目的探讨人腹膜中是否含有间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC),并研究其生物学特性。方法腹膜取自接受胃大部切除及腹腔淋巴结清扫术的胃癌患者。将腹膜剪碎,Ⅰ型胶原酶消化后以低密度接种,2周后计算细胞群中成纤维细胞集落形成... 详细信息

目的探讨人腹膜中是否含有间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC),并研究其生物学特性。方法腹膜取自接受胃大部切除及腹腔淋巴结清扫术的胃癌患者。将腹膜剪碎,Ⅰ型胶原酶消化后以低密度接种,2周后计算细胞群中成纤维细胞集落形成单位(Colony-forming unit-fibroblast,CUF-F)数量;流式细胞分析贴壁细胞表型;定向诱导2周后,碱性磷酸酶和油红O染色,观察细胞体外成骨和成脂肪能力。结果贴壁的细胞呈成纤维细胞样,消化的腹膜细胞群中,CFU-F比例平均为0.574‰(0.26‰～0.84‰)。流式分析显示,细胞均一表达CD29、CD44和CD73,不表达CD31、CD34和CD45。成骨细胞定向诱导后,细胞呈现碱性磷酸酶活性;成脂诱导后细胞内出现脂肪滴,油红O染色阳性。结论人腹膜中富含MSC,可作为一个含有生物支架的干细胞来源。

关键词：间充质干细胞腹膜成纤维细胞集落形成单位

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裸鼠造血微环境损伤实验动物模型的建立

中国实用内科杂志 2007年第S1期27卷 146-146页

作者：张曦陈幸华司英健刘耀高蕾高力彭贤贵王庆余第三军医大学新桥医院血液科重庆400037

目的建立适合移植实验使用的裸鼠造血微环境损伤动物模型。方法分别用3.5 Gy、5.0 Gy、6.5 Gy、8.0 Gy4个 Co60γ辐射剂量照射裸鼠,检测经过辐照后各组裸鼠第1、3、5、7、14、21天血象变化,检测辐射后第1、7、14、21天裸鼠骨髓基质成纤... 详细信息

目的建立适合移植实验使用的裸鼠造血微环境损伤动物模型。方法分别用3.5 Gy、5.0 Gy、6.5 Gy、8.0 Gy4个 Co60γ辐射剂量照射裸鼠,检测经过辐照后各组裸鼠第1、3、5、7、14、21天血象变化,检测辐射后第1、7、14、21天裸鼠骨髓基质成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)形成情况,并用流式细胞仪检测辐射后第1、7、14。

关键词：造血微环境裸鼠实验动物模型适宜辐射剂量成纤维细胞集落形成单位血象变化造血损伤流式细胞仪检测形成情况移植