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志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列系统结构特征的生物信息学分析

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生物医学工程学杂志 2015年第2期32卷 343-349页

作者：王鹏飞王颖芳段广才薛泽润王琳琳郭向娇杨海燕郗园林郑州大学公共卫生学院流行病学教研室郑州450001 河南科技大学医学院公共卫生教研室洛阳471003 新乡医学院新乡453003

利用生物信息学方法探索志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统结构的特征。本文通过BLAST、序列比对、RNA二级结构预测等方法对志贺菌CRISPR进行研究。结果显示:志贺菌的4个群中均发现有CRISPR结构,其侧翼上、下游序列可... 详细信息

利用生物信息学方法探索志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统结构的特征。本文通过BLAST、序列比对、RNA二级结构预测等方法对志贺菌CRISPR进行研究。结果显示:志贺菌的4个群中均发现有CRISPR结构,其侧翼上、下游序列可分为相同组群,在leader序列中存在具有回文性质、相对保守的motif;侧翼序列与重复序列具有相同的分组,重复序列有一定的保守性,可以形成以"茎"为主和以"环"为主两类不同的RNA二级结构;间隔序列与质粒或噬菌体有一定的同源性。本研究表明重复序列与侧翼序列间存在相关性,重复序列可能作为一种识别机制来介导外源元素与Cas蛋白间的相互作用。

关键词：志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列侧翼序列重复序列间隔序列

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中华实验外科杂志 2020年第12期37卷 2226-2228页

作者：史啸立杨人杰李相成俞悦南京医科大学第一附属医院肝胆中心/肝移植中心国家卫健委活体肝移植重点实验室中国医学科学院活体肝移植重点实验室 210029

目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA(crRNA)-cr... 详细信息

目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA(crRNA)-crRNA001/002/003,应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞,48 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出效率最高者crRNA001,并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板;用crRNA001和ssODN共转染肝细胞,模板特异性引物行PCR,验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。结果Sanger测序结果显示,crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后,模板特异性引物行PCR,能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带;二代测序结果显示,ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率,相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因,为进一步的体内实验提供理论和实验基础。

关键词：威尔森氏症成簇的规律间隔的短回文重复序列基因治疗铜离子转运ATP酶β肽核糖核蛋白体

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基于单管式LAMP-CRISPR/Cas12a技术的优化及其在甲型流感病毒检测性能的评估

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病毒学报 2025年

作者：汪雅婷朱灿灿尹雪儿姚杰王琴安徽医科大学第二附属医院检验科中国科学院合肥物质科学研究院

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）与将成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR/Cas12a）技术相结合，建立一种快速、准确、无污染的甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）的单管式检测方法（LAMP-CRISP... 详细信息

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）与将成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR/Cas12a）技术相结合，建立一种快速、准确、无污染的甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）的单管式检测方法（LAMP-CRISPR/Cas12a），并探讨其在临床诊断中的应用价值。设计并筛选最佳crRNA和LAMP引物，优化反应缓冲液、ssDNA reporter浓度以及CRISPR/Cas12a反应温度，建立单管式LAMP-CRISPR/Cas12a检测体系，并对该方法的灵敏度、特异性和临床实用性进行了评估。LAMP-CRISPR/Cas12a单管一步法可在45min内实现IAV的检测，灵敏度为10拷贝/μL，检测常见呼吸道病原体RSV-A、RSV-B、PIV3、IBV和SARS-CoV-2结果均为阴性，特异性良好；10例临床样本检测结果均与临床诊断结果相符，且LAMP-CRISPR/Cas12a与PCR法均一致。LAMP-CRISPR/Cas12a单管法检测IAV简便、快速、灵敏度高，且特异性强，无需开盖操作，避免了气溶胶污染，有望成为快速检测IAV的新方法。

关键词：环介导等温扩增成簇的规律间隔的短回文重复序列甲型流感病毒体系优化

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工业微生物基因组编辑技术的研究进展

生物工程学报 2015年第3期31卷 338-350页

作者：朱林江李崎江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品安全与营养协同创新中心江苏无锡214122

近年来,基因组范围的高效编辑技术发展迅速,对工业微生物基因组的改造效率不断提升,彻底改变了以"一次操作、一个抗性基因、一个修饰位点"为特征的传统遗传操作模式,实现了基因组上多重位点的同步编辑,精确高效且无需抗生素辅助的插入... 详细信息

近年来,基因组范围的高效编辑技术发展迅速,对工业微生物基因组的改造效率不断提升,彻底改变了以"一次操作、一个抗性基因、一个修饰位点"为特征的传统遗传操作模式,实现了基因组上多重位点的同步编辑,精确高效且无需抗生素辅助的插入替换或删除,以及大片段基因组DNA的剪切-粘贴等。这些技术的应用,能够高效构建优良性能的生产菌株,必将推动传统发酵产业的革新,促进以新能源和新材料为基础的新型工业生物技术的发展。本文针对这些新技术的原理和特点,结合一些典型应用实例,进行分析和总结,希望能为工业微生物的改造与构建提供参考与借鉴。

关键词：基因组编辑寡核苷酸介导的重组成簇的规律间隔的短回文重复序列二型内含子进化工程

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无乳链球菌分子流行病学研究进展

中国感染与化疗杂志 2021年第4期21卷 489-494页

作者：赵晶刘静娴刘瑛上海交通大学医学院附属新华医院检验科上海200092

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),20世纪30年代由Rebecca Lancefield分离自患牛乳腺炎的奶牛而得名,因其具有兰氏B组抗原,又称被称为B族链球菌(Group B Streptococcus)。《伯杰氏细菌鉴定手册》将其描述为革兰染色阳性、触酶阴性... 详细信息

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),20世纪30年代由Rebecca Lancefield分离自患牛乳腺炎的奶牛而得名,因其具有兰氏B组抗原,又称被称为B族链球菌(Group B Streptococcus)。《伯杰氏细菌鉴定手册》将其描述为革兰染色阳性、触酶阴性的兼性厌氧菌,呈球形或卵圆形,直径小于2μm。

关键词：无乳链球菌分子流行病学荚膜血清型多位点序列分型脉冲场凝胶电泳多位点可变数目重复序列分析成簇的规律间隔的短回文重复序列

基于CRISPR-Cas13a和RT-RAA的HIV核酸检测方法的建立

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中国艾滋病性病 2022年第3期28卷 264-270页

作者：李小辉粟斌寇志华吴昊张彤孙岩松韩尧乔惠丽李浩姜太一南阳师范学院生命科学与农业工程学院河南南阳473061 首都医科大学附属北京佑安医院感染中心北京100069 军事医学研究院微生物流行病研究所北京100071

目的探索一种基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和反转录重组酶介导的等温扩增(RTRAA)技术HIV核酸检测新方法的可行性。方法在HIV网络数据库***下载HIV CRF07_BC亚型基因序列,根据保守序列设计RT-RAA引物和crRNA。通过荧光法C... 详细信息

目的探索一种基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和反转录重组酶介导的等温扩增(RTRAA)技术HIV核酸检测新方法的可行性。方法在HIV网络数据库***下载HIV CRF07_BC亚型基因序列,根据保守序列设计RT-RAA引物和crRNA。通过荧光法CRISPR核酸检测筛选crRNA;利用梯度稀释的HIV RNA模板评价荧光法和试纸法CRISPR核酸检测的灵敏度;利用6种病原体核酸和不同亚型的HIV临床样本评价该方法的特异性。结果从5条候选的crRNA中筛选出了1条检测灵敏度较高的crRNA;荧光法和试纸法CRISPR核酸检测HIV RNA的灵敏度均为10拷贝/μL,与RT-qPCR法的灵敏度一致。荧光法和试纸法CRISPR核酸检测均可特异性检出HIV CRF07_BC亚型,与其他病原体核酸无明显交叉反应。在20例HIV临床样本检测中,试纸法CRISPR核酸检测准确检出了10例CRF07_BC以及1例B亚型。结论本研究建立了针对HIV CRF07_BC亚型的CRISPR核酸检测方法,具有便携、快速、高灵敏度和特异性的特点,为HIV感染者的检测和抗病毒治疗过程监测提供新的方法。

关键词：艾滋病病毒成簇的规律间隔的短回文重复序列等温扩增 CRF07_BC亚型核酸检测

水产品中人鱼共患细菌性病原分子生物学检测方法研究进展

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食品安全质量检测学报 2022年第22期13卷 7236-7245页

作者：高子惠朴永哲宫月张璜郑秋月曹际娟大连民族大学生命科学学院生物技术与资源利用教育部重点实验室大连116600 大连海关技术中心大连116001 广州双螺旋基因技术有限公司广州510630

水产行业是国民经济重要产业之一,水产养殖过程中病原微生物造成鱼类病害频发,人鱼共患病原菌会对人类健康构成威胁,水产品安全问题日益突出。人鱼共患病原菌检测方法对于病害的发现、预防及水产行业的健康可持续发展具有重要意义。人... 详细信息

水产行业是国民经济重要产业之一,水产养殖过程中病原微生物造成鱼类病害频发,人鱼共患病原菌会对人类健康构成威胁,水产品安全问题日益突出。人鱼共患病原菌检测方法对于病害的发现、预防及水产行业的健康可持续发展具有重要意义。人鱼共患病原菌包括人鱼共患细菌性病原和人鱼共患寄生虫病原等。本文对水产品中常见的人鱼共患细菌性病原的种类及其危害性、细菌性病原分子生物学检测方法的原理和应用及成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)基因编辑技术在病原菌检测方面的最新研究进展进行了综述,为研发易携带且简便快速的新型核酸检测方法及产品及水产品中人鱼共患病原菌的检测和防治提供参考和借鉴。

关键词：水产品人鱼共患细菌性病原分子生物学成簇的规律间隔的短回文重复序列

合成生物学在下一代基因诊断技术中的应用进展

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合成生物学 2023年第2期4卷 318-332页

作者：吕海龙王建吕浩王金徐勇顾大勇深圳大学医学部生物医学工程学院广东省生物医学信息检测与超声成像重点实验室广东深圳518060 深圳市第二人民医院深圳市转化医学研究院广东深圳518035 深圳市第二人民医院检验科深圳市医学检验分子诊断重点实验室广东深圳518035 深圳市第二人民医院神经外科深圳市神经外科重点实验室广东深圳518037 上海吐露港生物科技有限公司上海200233

近年来,合成生物学技术取得了飞速的发展,与此同时也极大地推动了基因诊断领域的技术革新和应用拓展。准确诊断疾病和监测治疗后反应的检测方法对有效的临床管理至关重要,合成生物学作为一门以设计为导向的学科,试图重新设计生物系统,... 详细信息

近年来,合成生物学技术取得了飞速的发展,与此同时也极大地推动了基因诊断领域的技术革新和应用拓展。准确诊断疾病和监测治疗后反应的检测方法对有效的临床管理至关重要,合成生物学作为一门以设计为导向的学科,试图重新设计生物系统,以便以可预测的方式执行新的功能,对这一领域的最新进展进行综述对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。本文以该主题作为切入点,首先介绍了目前合成生物学在基因诊断中的应用类别,包括已经被开发出来的用于体外和体内的不同生物传感器;随后介绍了下一代基因诊断技术的发展方向以及基因诊断领域的合成生物学装置和技术进展;此外,本文讨论了目前基因诊断领域中存在的技术问题及其在临床应用中面临的挑战。最后,我们提请注意合成生物学中的最新创新,这些创新可能会对基因诊断的未来应用产生重大影响。

关键词：合成生物学基因诊断成簇的规律间隔的短回文重复序列转化医学生物技术

运用CRISPR/Cas9技术构建PCSK9及CBS点突变家兔心血管疾病模型的实验研究

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运用CRISPR/Cas9技术构建PCSK9及CBS点突变家兔心血管疾病模型的...

作者：严坤宁扬州大学

学位级别：硕士

目的心血管疾病是一类严重威胁我国居民健康的常见病,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建S386A-PCSK9和G307S-CBS两种点突变家兔模型,以进一步阐明突变的PCSK9和CBS基因对脂质代谢以及心血管疾病的影响。方法1.阅读文献,选择PCSK9和... 详细信息

目的心血管疾病是一类严重威胁我国居民健康的常见病,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建S386A-PCSK9和G307S-CBS两种点突变家兔模型,以进一步阐明突变的PCSK9和CBS基因对脂质代谢以及心血管疾病的影响。方法1.阅读文献,选择PCSK9和CBS基因的突变位点,根据Pub Med基因蛋白数据对人和兔的PCSK9及CBS的蛋白功能区进行Blast分析。2.根据家兔点突变对应的碱基替换位置及序列分析结果设计sgRNA和ssODN。3.将体外转录好的sgRNA、Cas9-mRNA和ssODN共同注射入家兔受精卵胞质内并将受精卵移植到待孕母兔体内。4.对获得的F0代兔进行PCR、TA克隆、脱靶检测以鉴定是否突变成功。5.根据基因测序后得到的氨基酸序列进行蛋白结构模拟,预测突变对蛋白结构产生的影响。6.通过血脂检测、脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析突变兔的脂质代谢情况。7.待PCSK9突变兔12周龄时给予10周高脂饮食,然后剖取主动脉进行油红O染色、H＆E染色、马松染色以及平滑肌细胞、巨噬细胞和TNF-α的免疫组织化学染色,取肝脏组织进行TNF-α的免疫组织化学染色。8.给CBS突变兔喂食维生素B和甜菜碱复合物,观察药物对突变兔的血脂、血浆同型半胱氨酸和肝脏组织脂质含量的影响。结果1.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术共获得15只S386A-PCSK9 F0代兔和6只G307S-CBS F0 代兔。2.测序结果表明有1只S386A-PCSK9点突变纯合子和2只S386A-PCSK9点突变杂合子。设计的3条sgRNA在预测范围内未发生脱靶。蛋白结构模拟结果表示突变兔的PCSK9蛋白均发生了不同程度的结构变化。血脂检测结果发现在正常饮食条件下,与WT兔相比,S386A-PCSK9-/-兔和一只S386A-PCSK9+/-突变兔的血浆低密度脂蛋白胆固醇水平、总胆固醇、甘油三酯水平降低,高密度脂蛋白胆固醇水平升高,脂蛋白检测结果与此一致。特殊染色和免疫组织化学染色结果显示,与WT兔相比,S386A-PCSK9+/-兔的内膜增厚不明显,平滑肌细胞迁移水平下降,内膜浸润的巨噬细胞数量减少,肝脏的炎症水平下降。另一只S386A-PCSK9+/-突变兔的血脂、脂蛋白水平和动脉粥样硬化斑块面积与WT兔相比没有明显差异,这可能与它的突变方式有关。S386A-PCSK9型突变可以稳定遗传。***基因突变兔在出生后6周内出现明显的生长发育迟缓和死亡率高的现象。与同周龄的WT兔相比,6周龄G307S-CBS兔的血浆同型半胱氨酸、甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平更高。对突变兔肝脏组织的H＆E染色结果显示,突变兔肝细胞内有微泡状的胞浆脂滴积聚。给突变兔喂食维生素B和甜菜碱复合物可以显著降低CBS突变兔的血浆甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平,并减轻肝脏脂肪变性的情况。结论1.利用CRISPR/Cas9技术成功构建了 S386A-PCSK9及G307S-CBS点突变家兔模型。2.S386A-PCSK9突变对动脉粥样硬化有抵御作用。模型的构建可能为探究S386A点突变对PCSK9蛋白功能减弱的分子机制,开发可靠、有效的诊断和治疗措施提供了合适的动物模型。3.本研究构建的G307S-CBS家兔在正常饮食条件下血脂发生明显异常,表明CBS基因的G307S突变是导致血脂异常的一个因素。

关键词：前蛋白转化酶枯草溶菌素9 胱硫醚β-合成酶点突变高同型半胱氨酸血症血脂异常新西兰兔成簇的规律间隔的短回文重复序列