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改良5'-核苷酸酶-碱性磷酸酶双染色法观察成牙本质细胞层毛细淋巴管

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牙体牙髓牙周病学杂志 2010年第8期20卷 430-432,436页

作者：宫艳红汪竹平王铎亓庆国贺长历宋培珍山东省千佛山医院山东济南250014 山东大学口腔医院山东济南250012

目的:对5'-核苷酸酶-碱性磷酸酶(5'-nucleotidase-alkaline phosphatase,5'-Nase-ALPase)双染色法进行改良,并用其染色观察牙髓成牙本质细胞层是否存在毛细淋巴管。方法:选用牙根发育完成的健康恒前磨牙共44个。首先取15个牙,分为3组,... 详细信息

目的:对5'-核苷酸酶-碱性磷酸酶(5'-nucleotidase-alkaline phosphatase,5'-Nase-ALPase)双染色法进行改良,并用其染色观察牙髓成牙本质细胞层是否存在毛细淋巴管。方法:选用牙根发育完成的健康恒前磨牙共44个。首先取15个牙,分为3组,分别用单纯冰冻法、先冰冻后固定法、先固定后冰冻法处理牙髓,选取适用于本研究的标本制备方法。然后取8个牙的牙髓切片对5'-Nase-ALPase双染色法从ALPase反应底物量和反应时间上进行改良。最后取21个牙,其中12例牙髓的切片用改良双染色法染色,9例分3组作对照染色,在光镜下观察成牙本质细胞层中的毛细淋巴管。结果:用改良5'-Nase-ALPase双染色法发现在被染为淡蓝色的成牙本质细胞层中有呈褐色或浅黄色的毛细淋巴管。结论:在牙根发育完成的健康恒前磨牙成牙本质细胞层中有毛细淋巴管。

关键词：前磨牙成牙本质细胞毛细淋巴管 5'-核苷酸酶-碱性磷酸酶双染色法

Krüppel样因子4在成牙本质细胞分化及口腔鳞状细胞癌中作用的研究进展

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口腔医学研究 2018年第7期34卷 692-694页

作者：黄玲燕叶盛佳叶雁翎方平娟温州医科大学浙江温州325027 温州医科大学附属口腔医院牙体牙髓科浙江温州325027

Krüppel样因子4(Krüppel-like factors 4,KLF4)是一种在全身多处表达的锌指转录因子,参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育及肿瘤发生等众多重要生理病理过程,其在口腔中也有特异性表达。本文从KLF4的结构、生物学功能、在成牙本质细胞... 详细信息

Krüppel样因子4(Krüppel-like factors 4,KLF4)是一种在全身多处表达的锌指转录因子,参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育及肿瘤发生等众多重要生理病理过程,其在口腔中也有特异性表达。本文从KLF4的结构、生物学功能、在成牙本质细胞分化中的作用及其在口腔鳞状细胞癌中的作用等方面的研究进展作一综述。

关键词： Krüppel样因子4 成牙本质细胞口腔鳞状细胞癌

CD47分子在成牙本质细胞炎性损伤修复中的作用机制

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CD47分子在成牙本质细胞炎性损伤修复中的作用机制

作者：王海胜武汉大学

学位级别：硕士

实验目的:成牙本质细胞在感染及炎症中的存活能力很大程度上决定着牙髓炎的预后。整合素相关蛋白(Integrin associated proteins,IAP or CD47)是活细胞表面广泛表达的“自我识别分子”,且与细胞自噬及凋亡密切相关。本研究利用人炎症牙... 详细信息

实验目的:成牙本质细胞在感染及炎症中的存活能力很大程度上决定着牙髓炎的预后。整合素相关蛋白(Integrin associated proteins,IAP or CD47)是活细胞表面广泛表达的“自我识别分子”,且与细胞自噬及凋亡密切相关。本研究利用人炎症牙髓组织和体外经脂多糖(lipopolysaccharide)处理的小鼠牙乳头细胞系(mDPC6T),探讨了炎症刺激影响下CD47分子表达变化以及与自噬和细胞凋亡之间的关系。实验方法:①临床收集人牙髓标本,根据其牙髓损伤状况分为健康组、龋病组和牙髓炎组,分别提取牙髓组织蛋白或制备组织切片备用;②利用免疫组织化学染色(Immunohistochemical staining,IHC)定位不同组牙髓组织中炎症因子,自噬标志分子及细胞凋亡指标表达部位;③利用免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)共定位各组牙髓组织中CD47分子表达与自噬标签蛋白LC3;④免疫印迹实验(Western blotting,WB)检测不同组牙髓组织中CD47分子表达水平炎症水平,炎症水平,自噬水平以及细胞凋亡水平的变化;⑤体外实验中,利用1μg/mlLPS处理mDPC6T细胞,分别检测6小时、12小时、18小时、24小时后CD47、自噬相关蛋白及细胞凋亡的表达变化;⑥进一步利用小RNA干扰技术敲低CD47表达,检测并比较各组间自噬相关蛋白及细胞凋亡的变化差异;⑦利用生物信息学技术寻找CD47分子胞内信号通路关键蛋白,利用IHC及IF技术初步探究人牙髓标本中关键蛋白分子、CD47配体分子SIRPα分子的表达,以及巨噬细胞的聚集水平。实验结果:①在牙髓组织炎症进展过程中,炎症因子,自噬相关蛋白以及细胞凋亡指标的表达主要定位于成牙本质细胞层;②免疫印迹实验结果显示:牙髓标本中炎症水平的升高的同时,CD47分子表达水平的显著下降,且自噬增强、凋亡水平升高;③CD47与LC3在龋病组和牙髓炎组成牙本质细胞层存在显著共表达;④在经LPS处理的mDPC6T细胞系中,CD47分子的减少伴随自噬的持续激活以及细胞凋亡的增加;⑤CD47特异性敲低后,细胞自噬和凋亡增加;⑥生物信息学分析发现TRAF6为CD47胞内信号转导可能的关键分子,IHC和IF结果显示TRAF6表达水平与炎症水平呈正相关,且SIRPα表达水平以及巨噬细胞聚集水平也与炎症水平正相关。实验结论:炎症微环境下成牙本质细胞自噬及凋亡水平均升高;随着炎症损伤的加剧,“自我识别分子”CD47表达的持续降低与成牙本质细胞自噬及凋亡水平的增加有关。

关键词：成牙本质细胞自噬炎症轻链蛋白-3 脂多糖龋病

纳米羟基磷灰石颗粒尺度及浓度对成牙本质细胞增殖和成矿的影响

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纳米羟基磷灰石颗粒尺度及浓度对成牙本质细胞增殖和成矿的影响

作者：李娜浙江大学

学位级别：硕士

研究背景：成牙本质细胞是人体中形成牙齿硬组织结构——牙本质的唯一细胞,在机体发育成熟后仍能产生修复性牙本质并随着年龄的增长产生继发性牙本质。而羟基磷灰石是组成人体骨组织和牙组织的基本无机单位,纳米级别的羟基磷灰石有其特... 详细信息

研究背景：成牙本质细胞是人体中形成牙齿硬组织结构——牙本质的唯一细胞,在机体发育成熟后仍能产生修复性牙本质并随着年龄的增长产生继发性牙本质。而羟基磷灰石是组成人体骨组织和牙组织的基本无机单位,纳米级别的羟基磷灰石有其特殊的生物学性质,新近研究发现纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite particle,nano-HAP）有促进成骨细胞增殖和矿化的功能。但其中对成牙本质细胞生长和成矿的作用目前国内外尚无研究报道。目的：探讨不同尺度及不同浓度纳米羟基磷灰石颗粒对永生化成牙本质细胞（MDPC-23）增殖和矿化的影响。方法：根据临界胶束理论制备获得20nm、40nm、70nm大小的羟基磷灰颗粒（np20、np40、np70）,傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared, FTIR）,X线衍射（X-ray diffraction, XRD）,场发射扫描电镜（Field emission scanning electron microscopy, FESEM）,透射电镜（Transmission electron microscopy, TEM）用来对颗粒大小形貌及化学组成晶体纯度进行检测。在96孔板中加入含有np20,np40,np70及对照组不含羟基磷灰石颗粒培养液,设三种不同浓度,分别为20μg ml-1,50μg ml-1,100gg ml-1,加入5×103/3L细胞,每种材料均设8复孔,放入37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养,于培养1,3,5,7天测MTT值,拍摄透射电镜及倒置显微镜图片,比较不同颗粒大小、浓度的nano-HAP在不同培养时期对MDPC-23增殖和成矿的影响。结果：np20,np70在培养初期有明显的促进MDPC-23生长的作用,培养后期促进效果不明显,np40显著地抑制MDPC-23的生长。培养初期,nano-HAP浓度越高,抑制细胞生长作用明显,随着培养时间的延长,抑制作用降低,但浓度高的np40抑制细胞生长的作用仍高于低浓度。不同浓度的各种颗粒尺度的nano-HAP对MDPC-23成矿促进作用不明显。TEM观察到各种尺度的nano-HAP均进入细胞,对MDPC-23产生作用。结论：np20,np70对MDPC-23的生长和成矿无明显的促进作用,np40抑制成牙本质细胞的生长。

关键词：纳米羟磷灰石成牙本质细胞颗粒尺度浓度

热休克蛋白70在第三磨牙成牙本质细胞中表达的增龄变化

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现代口腔医学杂志 2009年第6期23卷 637-639页

作者：赵晓花朱庆萍江苏省常州市口腔医院口腔内科 213003 江苏省口腔医院特诊科

目的观察热休克蛋白70(heat shock protein70 HSP70)在第三磨牙成牙本质细胞中表达的增龄变化。方法共选取33例21～30岁、31～40岁、41～50岁和51～60岁四个年龄组健康第三磨牙的组织标本进行免疫组化染色,并通过计算机图像分析对比四... 详细信息

目的观察热休克蛋白70(heat shock protein70 HSP70)在第三磨牙成牙本质细胞中表达的增龄变化。方法共选取33例21～30岁、31～40岁、41～50岁和51～60岁四个年龄组健康第三磨牙的组织标本进行免疫组化染色,并通过计算机图像分析对比四组牙髓组织成牙本质细胞中HSP70表达量的不同。结果41～50岁和51～60岁年龄组平均光密度值明显低于21～30岁年龄组和31～40岁年龄组(P成牙本质细胞中的表达强度显著下降。

关键词：热休克蛋白70 成牙本质细胞增龄变化

SLPI在成牙本质细胞分化中的作用和机制研究

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SLPI在成牙本质细胞分化中的作用和机制研究

作者：袁芳昆明理工大学

学位级别：硕士

龋齿严重威胁人类的健康并且发病率极高,龋齿会引发牙周炎,引起心血管疾病、糖尿病、败血症等并发症。目前治疗龋齿的主要方法是物理填充,但是该方法给患者带来极大的痛苦,并且并不能从生理上逆转,因此人类牙齿再生是一项非常具有市场... 详细信息

龋齿严重威胁人类的健康并且发病率极高,龋齿会引发牙周炎,引起心血管疾病、糖尿病、败血症等并发症。目前治疗龋齿的主要方法是物理填充,但是该方法给患者带来极大的痛苦,并且并不能从生理上逆转,因此人类牙齿再生是一项非常具有市场价值、社会效益和应用前景的研究工作。牙齿的发育机制研究为人工培育牙齿提供理论和实验依据。牙齿发育是一个长期复杂的过程,是上皮间充质相互诱导的结果。包括牙胚的发生、形成、细胞的分化、基质分泌和矿化等几个阶段。现在牙齿的形态发育已经基本研究清楚,但在分子机制方面,仍有很多待我们探索。在牙本质的发育过程中,牙本质基质蛋白发挥重要作用,主要包括ColⅠ、BSP、OCN、ON、DSPP等蛋白。SLPI为粘膜上皮细胞分泌的非糖基化单链多肽蛋白,包含107个氨基酸,属于乳清酸蛋白家族。SLPI由两条高度同源性的,富含半胱氨酸区和C末端区组成,C末端区具有抑制弹性蛋白酶的作用,N末端区有抗菌、抗逆转录病毒和抗炎活性。我们的预实验中首次发现SLPI与牙齿发育相关。另外,虽然有基底膜与成牙本质细胞分化相关的报道,但SLPI在牙本质发育过程中有什么作用?通过什么样的分子机制实现?尚不清楚。因此,有必要对SLPI在成牙本质细胞分化、基底膜降解与牙本质发生中的作用机制的机理进行深入的探讨,以揭示其分子作用机制,为牙齿发育不全和牙本质发育不全的干预治疗以及牙齿修复与再生提供实验和理论基础。本论文以永生化小鼠成牙本质细胞MDPC-23细胞和小鼠为模型,建立了SLPI基因过表达和沉默的稳定细胞株,并利用SLPI基因敲除型和野生型小鼠研究SLPI牙齿发育中的作用和机制,为牙齿再生研究提供实验依据和理论基础。实验内容和结果:1、通过无缝克隆法构建鼠源SLPI基因过表达载体p LVX-SLPI-IRES-Zs Green1,用T4连接法构建鼠源SLPI基因沉默载体p LVX-SLPI-sh RNA2。2、将所构建的质粒进行慢病毒包装,感染MDPC-23细胞,通过流式分选得到稳定细胞株,RT-PCR实验验证所构建质粒中SLPI m RNA的表达情况,确认鼠源SLPI基因过表达和沉默稳转细胞系构建成功。3、通过茜素红染色实验和RT-PCR实验研究发现SLPI过表达促进MDPC-23细胞分化矿化,内源性SLPI促进OCN、ON、ColⅠ、DSPP m RNA的表达,抑制BSP m RNA的表达;基底膜促进成牙本质细胞的分化矿化,SLPI促进OCN、ON、ColⅠ、DSPP m RNA的表达,抑制BSP m RNA的表达。4、通过对野生型和SLPI敲除型小鼠的发育牙组织进行免疫组化和马森三色染色实验研究发现,SLPI促进OCN、ColⅠ蛋白的表达以及基底膜降解,抑制BSP、DSPP蛋白的表达,ON表达量始终很低,SLPI表达消失时,基底膜也消失。后续仍需进一步优化基底膜铺板条件,并对基底膜与牙髓干细胞分化展开研究。

关键词： SLPI 基底膜成牙本质细胞细胞分化

c-Myc激活人成牙本质细胞样细胞端粒酶的实验研究

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口腔医学研究 2003年第2期19卷 88-91页

作者：王捍国肖明振赵守亮贾骏王景杰郝建军第四军医大学口腔医学院牙体病科陕西西安710032

目的 :明确在人成牙本质细胞样细胞内c -Myc可否调控端粒酶活性。方法 :将c -Myc基因转染至原代人成牙本质细胞样细胞样细胞 ,G418筛选后检测细胞内c -Myc和端粒酶逆转录酶 (telomerasereversetranscrip tase ,TERT)的表达以及端粒酶... 详细信息

目的 :明确在人成牙本质细胞样细胞内c -Myc可否调控端粒酶活性。方法 :将c -Myc基因转染至原代人成牙本质细胞样细胞样细胞 ,G418筛选后检测细胞内c -Myc和端粒酶逆转录酶 (telomerasereversetranscrip tase ,TERT)的表达以及端粒酶活性。结果 :c -Myc稳定整和入细胞并表达蛋白 ,该转染细胞在mRNA和蛋白质水平上TERT的表达上调 ,端粒酶活性转为阳性。结论 :在人成牙本质细胞样细胞样细胞内 ,外源性c -Myc基因可以通过上调TERT的表达水平而激活端粒酶 ,为建立永生化人成牙本质细胞样细胞系奠定了基础。

关键词：成牙本质细胞端粒酶 c-Myc基因端粒酶逆转录酶

FoxO3a调控自噬参与成牙本质细胞炎性损伤修复的机制研究

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FoxO3a调控自噬参与成牙本质细胞炎性损伤修复的机制研究

作者：李媛武汉大学

学位级别：硕士

实验目的:成牙本质细胞是抵御致龋菌感染的重要屏障,这些细胞的存活对牙髓炎的预后有重要意义。研究发现自噬在成牙本质细胞炎症损伤修复中发挥重要作用。Fox03a属于转录因子FoxO家族,可参与对自噬的转录性调节。但调控炎症所诱导的成... 详细信息

实验目的:成牙本质细胞是抵御致龋菌感染的重要屏障,这些细胞的存活对牙髓炎的预后有重要意义。研究发现自噬在成牙本质细胞炎症损伤修复中发挥重要作用。Fox03a属于转录因子FoxO家族,可参与对自噬的转录性调节。但调控炎症所诱导的成牙本质细胞自噬的具体转录因子尚不明确。本实验利用人炎症牙髓组织和在体外经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的小鼠牙乳头细胞系(mDPC6T),探讨转录因子Fox03a通过调节自噬参与成牙本质细胞炎性损伤修复的作用机制。实验方法:临床收集人第三磨牙或正畸拔除牙,并根据牙髓状况将其分为健康组、龋病组和不可逆性牙髓炎组。分别提取牙髓组织进行免疫印迹实验;牙齿脱矿处理后进行组织切片以备用。利用免疫印迹实验检测人牙髓组织中肿瘤坏死因子TNFa,转录因子Fox03a和自噬相关指标的表达量;利用免疫组织化学实验检测Fox03a和自噬相关蛋白在成牙本质细胞中的表达部位;利用免疫荧光实验观察随炎症程度的加深,Fox03a在人牙髓组织细胞中的亚细胞定位的变化。在体外,用1μg/ml的LPS对小鼠前成牙本质细胞mDPC6T分别给予6小时、12小时、24小时处理建立成牙本质细胞炎症损伤模型。培养终止后,用免疫印迹实验检测Fox03a和自噬相关指标蛋白水平的表达,用细胞免疫双荧光实验检测FoxO3a与LC3的共定位及Fox03a的细胞核转位变化。最后,用RNA小干扰技术将Fox03a敲低,免疫印迹实验检测Fox03a减少后自噬相关蛋白量的变化。实验结果:免疫印迹和免疫组织化学实验结果显示,Fox03a和自噬相关蛋白(Beclinl、Atg5-Atg12、LC3)在成牙本质细胞层和相邻组织的表达随着炎症程度的增加而显著上升(P成牙本质细胞胞质和胞核的表达量逐渐增加;在体外实验中,一定浓度范围内的LPS刺激使自噬相关蛋白(Beclinl、Atg12-Atg5、LC3)和Fox03a在炎症早期显著增加(P成牙本质细胞的炎性损伤修复过程。

关键词： FoxO3a 自噬炎症成牙本质细胞

Smurf1介导的对Runx2表达调控在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中的作用

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Smurf1介导的对Runx2表达调控在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中...

作者：徐娜第四军医大学

学位级别：硕士

Runx2是一种胚胎发育期在牙源性和骨源性间充质细胞中均有表达的转录因子。研究显示，发育期间其在成骨细胞和成牙本质细胞分化过程中表达趋势不尽相同，提示分化过程中Runx2特定的表达形式可能是决定细胞向成骨或成牙本质细胞分化的关... 详细信息

Runx2是一种胚胎发育期在牙源性和骨源性间充质细胞中均有表达的转录因子。研究显示，发育期间其在成骨细胞和成牙本质细胞分化过程中表达趋势不尽相同，提示分化过程中Runx2特定的表达形式可能是决定细胞向成骨或成牙本质细胞分化的关键因子。泛素化修饰可通过控制Runx2蛋白的稳定性，调控Runx2的蛋白表达水平，Smurf1是蛋白泛素化降解调控通路中一种重要的E3泛素连接酶，其介导的泛素-蛋白酶体途径是调控Runx2表达的重要机制。那么Smurf1介导的Runx2泛素化蛋白降解途径是否在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中发挥着重要的作用呢？实验目的：本课题旨在比较Runx2在成牙本质细胞和成骨细胞分化过程中的表达水平和变化趋势，并利用shRNA慢病毒表达载体探讨牙髓干细胞内Smurf1对Runx2的表达调控作用，以及其在不同分化阶段对成牙本质细胞分化表型的影响，以揭示Smurf1介导的Runx2泛素化蛋白降解在牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化中发挥的调控作用。实验方法: 1.人牙髓干细胞（HDPSCs）的分离、培养及鉴定通过酶消化法和有限稀释法分离纯化出HDPSCs克隆，并进行扩大培养。利用流式细胞技术鉴定其间充质干细胞表面标记物，同时诱导细胞多向分化并进行鉴定。 2.检测并比较Runx2在干细胞向成牙本质和成骨细胞分化过程中的表达变化矿化液诱导培养人牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞3周，鉴定成牙本质细胞和成骨细胞分化表型，Western blot和实时定量PCR动态检测矿化液诱导培养0d,3d,5d,7d,14d,21d成牙分化和成骨分化过程中Runx2的表达变化。 3.探讨牙髓干细胞内Runx2表达受Smurf1介导的蛋白降解途径调控通过Smurf1shRNA慢病毒转染技术使牙髓干细胞内Smurf1基因沉默，然后用矿化诱导液诱导细胞分化，Western blot和实时定量PCR检测Runx2的表达，同时采用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂cycloheximide分别处理未分化的HDPSCs和Smurf1基因沉默HDPSCs，Western blot检测Runx2的表达。 4.研究Smurf1对成牙本质细胞分化表型的影响对Smurf1shRNA转染的牙髓干细胞进行矿化诱导培养7d和14d，茜素红染色检测矿化结节的形成，Western blot检测Runx2的表达，实时定量PCR检测成牙本质细胞相关表型的变化。结果： 1.细胞鉴定结果证实，所培养细胞为牙髓干细胞（DPSCs），具有干细胞相关特性，并且在矿化液诱导下可分化为成牙本质细胞，经成脂诱导可分化为脂肪细胞。 2. Runx2在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化过程中表达逐渐增高，细胞分化越成熟，表达越强。但在牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化过程中，Runx2表达总体呈先高后低的趋势，细胞分化早期较未分化时表达增高，到分化晚期和分化成熟时表达则明显下降。 3.在Smurf1shRNA转染的未分化HDPSCs内以及细胞经矿化诱导培养7天后，Runx2表达均明显增加，且这种表达变化仅体现在蛋白水平，Runx2mRNA水平的表达并无明显变化。蛋白酶体抑制剂MG132可使HDPSCs内Runx2蛋白水平明显增加，而Smurf1shRNA转染细胞经可阻断新蛋白的合成的蛋白合成抑制剂cycloheximide处理后，其内Runx2蛋白半衰期延长，降解速度明显减慢。 4. Smurf1基因沉默可明显促进矿化结节的形成;其对早期矿化基因表达并无明显影响;而在矿化晚期，而细胞内成牙本质细胞分化相关基因DSPP、DMP-1的表达降低，成骨细胞分化相关基因OCN、BSP的表达则增强。细胞成牙分化减弱，成骨分化增强。同时，Smurf1基因沉默明显上调了成牙本质细胞分化晚期Runx2的蛋白表达。结论：Smurf1在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的过程中通过UPS介导了对Runx2的泛素化降解。同时Smurf1还在成牙本质细胞分化晚期发挥重要作用，而这种作用可能是通过其介导的对Runx2的蛋白酶体降解来实现的，这可能作为一种调控细胞定向分化的关键机制参与调控成牙本质细胞的分化。为了进一步深入研究牙髓干细胞定向分化机制，慢病毒过表达载体将被用于进一步验证实验结果，Runx2shRNA用于深入探讨Smurf1介导的Runx2泛素化蛋白降解在成牙本质细胞定向分化中的调控作用，后续研究将着重于裸鼠体内移植实验，以研究该调控作用在组织工程领域的应用。

关键词： Runx2 Smurf1 牙髓干细胞成牙本质细胞分化