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成牙本质细胞极性相关蛋白cdc42和E-cadherin的表达及功能

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成牙本质细胞极性相关蛋白cdc42和E-cadherin的表达及功能

作者：李明伟第四军医大学

学位级别：硕士

成牙本质细胞是位于牙髓组织最外层的高柱状细胞，顶端能够分泌牙本质基质，底端位于牙髓组织内，是一种典型的极性化细胞。在成牙本质细胞的发生过程中，经历了从无极性化细胞分化发育成为极性化细胞的过程。该过程的进行同时也伴随着... 详细信息

成牙本质细胞是位于牙髓组织最外层的高柱状细胞，顶端能够分泌牙本质基质，底端位于牙髓组织内，是一种典型的极性化细胞。在成牙本质细胞的发生过程中，经历了从无极性化细胞分化发育成为极性化细胞的过程。该过程的进行同时也伴随着成牙本质细胞的成熟与牙本质基质的分泌。在细胞顶底极性建立过程中，细胞连接的形成和极性蛋白复合物的定位是两个必要的细胞生物学行为。细胞连接作为相邻细胞间的锚定结构，起到阻隔外来物质通透细胞层的作用，同时作为细胞膜分隔条带，将细胞膜区域分为顶端和底端。细胞连接的建立也为细胞极性复合物在细胞膜上的定位提供了锚定结构，是细胞极性形成的前提。细胞极性复合物的发生及其在细胞膜特定区域的定位则是细胞极性形成的分子基础。极性分子在细胞膜的定位决定了细胞膜相应区域的功能。同时，细胞连接的建立和极性分子的定位也可以影响细胞器在胞浆内的分布。发育成熟的成牙本质细胞，其细胞核位于细胞的底端，内质网、高尔基体等细胞器则朝向细胞的分泌端，即细胞顶端。这种细胞形态的形成正是其细胞极性化分泌功能的形态学基础。本课题采用多种分子生物学方法证实了与成牙本质细胞极性建立密切相关的部分蛋白的表达，并对其功能进行了初步探讨，以期为相关研究提供一定的基础。 1．成牙本质细胞部分极性蛋白的表达提取小鼠牙髓组织和OLCs细胞的总RNA和总蛋白后，用PCR检测cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherin mRNA的表达，用western blot检测cdc42蛋白的表达。OLCs细胞经固定、脱水、通透后，用细胞免疫荧光检测cdc42在OLCs中的表达定位。出生后2周小鼠及出生前14天、16天、18天胚胎小鼠经固定、脱水、浸蜡、包埋、切片后，用组织免疫荧光检测cdc42在牙胚发育过程中的表达。结果显示，cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherin mRNA及cdc42蛋白在牙髓组织和OLCs中皆有表达。在OLCs细胞膜和细胞浆中，cdc42皆有表达并且在细胞核周围表达量明显高于其他部位。在牙胚发育过程中，cdc42参与了成牙本质细胞极性化的发生过程。 2．成牙本质细胞细胞连接的体外建立及其与LPS的关系 OLCs接种于含有α-MEM培养液的transwell小室中培养两周后，通过扫描电镜观察细胞排列状态，通过透射电镜观察细胞间连接的建立。OLCs接种于6孔板中，各组培养液中加入不同浓度LPS（10ng/ml、100ng/ml、和1000ng/ml），以条件培养液（10ng/ml LPS）中同时加入NF-κB抑制剂PDTC和LPS组作为对照;分别培养0.5h、1h、2h、6h，各时间点采用Western blot观察细胞连接蛋白E-cadherin在蛋白水平的变化;以实时定量PCR观察细胞连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin在mRNA水平的改变。结果显示，经过立体培养的OLCs细胞间形成了明显的细胞连接。经过LPS处理后，ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin的mRNA表达水平明显降低，且在一定的作用时间范围内呈明显的时间依赖性，但与浓度（10-1000ng/ml）无明显依赖性。同时，E-cadherin在蛋白水平随着LPS作用时间的延长其表达水平逐渐降低，而NF-κB抑制剂PDTC时能够抑制这种效应。 3．cdc42与牙源性细胞矿化的关系 OLCs细胞接种培养至融合80%后，实验组分别更换为矿化诱导液、含10ng/mlLPS的α-MEM培养液和含10ng/ml LPS矿化诱导液经一定时间培养后，通过westernblot测定其中cdc42含量的变化;矿化诱导液组和含ML141的矿化诱导液组培养一定时间后，通过茜素红染色观察矿化结节形成情况并进行定量分析。HDPSCs在含不同浓度LPS的矿化诱导液和含不同浓度ML141的矿化诱导液中培养一定时间后，通过茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析。Western blot结果显示，OLCs中cdc42的表达在矿化诱导液的作用下未发生明显改变，在LPS作用下明显上调。茜素红染色结果显示，OLCs矿化结节的形成量与时间正相关，与ML141的浓度呈负相关;HDPSCs矿化结节的形成与LPS浓度正相关，与ML141浓度负相关。

关键词：成牙本质细胞细胞极性细胞连接细胞分裂周期蛋白42

瞬时感受器电位香草酸受体3离子通道蛋白在人成牙本质细胞中的表达

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中华口腔医学杂志 2013年第11期48卷 679-682页

作者：梁春云吴声胡德渝阙克华天津医科大学口腔医院牙体牙髓科 300070 四川大学华西口腔医学院预防科

目的通过免疫组织化学法研究瞬时感受器电位香草酸受体3（transientreceptorpotentialvanilloid3，TRPV3）离子通道蛋白在人成牙本质细胞（odontoblasts，OD）中的表达，以进一步丰富人OD离子通道的研究。方法选取18～25岁患者因正畸拔... 详细信息

目的通过免疫组织化学法研究瞬时感受器电位香草酸受体3（transientreceptorpotentialvanilloid3，TRPV3）离子通道蛋白在人成牙本质细胞（odontoblasts，OD）中的表达，以进一步丰富人OD离子通道的研究。方法选取18～25岁患者因正畸拔除的健康完整的第三磨牙20颗，HE染色确定组织切片质量，牙本质涎磷蛋白（dentinsialophosphoproteins，DSPP）抗体染色定位OD层，通过TRPV3通道蛋白特异性抗体染色分析TRPV3通道蛋白在人牙髓组织中的分布情况，重点观察TRPV3通道蛋白在OD层的分布特点，并用ImageProPlus软件半定量比较冠根不同部位ODTRPV3通道蛋白的表达情况。结果免疫组化结果显示冠根部牙髓OD胞体TRPV3通道蛋白表达阳性，冠部明显强于根部。OD细胞突起亦有TRPV3通道蛋白阳性表达，ImageProPlus分析显示，TRPV3通道蛋白在冠部OD细胞突起的表达（积分吸光度值为2516±162）与根髓外侧（积分吸光度值为2224±150）、根髓内侧（积分吸光度值为2121±92）比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；根髓外侧与内侧相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论人OD明显表达TRPV3通道蛋白，且在不同部位牙髓OD中存在表达差异。

关键词： TRPV阳离子通道免疫组织化学成牙本质细胞

低浓度β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞向成牙本质细胞分化及相关因子的表达

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中国组织工程研究 2015年第41期19卷 6688-6693页

作者：刘明月胡伟平王晓芬李宁曹潇方史欣王晓峰哈尔滨医科大学附属第二临床医院口腔修复科黑龙江省哈尔滨市150086 哈尔滨医科大学附属第二临床医院消化内科黑龙江省哈尔滨市150086 哈尔滨医科大学附属第二临床医院心内科黑龙江省哈尔滨市150086 哈尔滨医科大学附属第二临床医院牙体牙髓科黑龙江省哈尔滨市150086 哈尔滨医科大学附属第二临床医院口腔科教研室黑龙江省哈尔滨市150086

背景:以往研究用来诱导成牙本质细胞分化的培养基普遍借鉴成骨细胞的诱导浓度,其他浓度的诱导情况尚无相关研究。目的:观察在低浓度β-甘油磷酸钠条件培养下,牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中,牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞... 详细信息

背景:以往研究用来诱导成牙本质细胞分化的培养基普遍借鉴成骨细胞的诱导浓度,其他浓度的诱导情况尚无相关研究。目的:观察在低浓度β-甘油磷酸钠条件培养下,牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中,牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况。方法:分离培养人牙髓干细胞,用不同浓度的诱导液诱导牙髓干细胞分别向脂肪细胞,成骨细胞分化,证实其多向分化能力。用5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠诱导培养牙髓干细胞向牙本质细胞分化,分别在培养第7,14,21,28天提取各组细胞RNA,反转录PCR检测牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况;诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化形成的矿化结节用Alizarin Red S法检测。结果与结论:人牙髓干细胞经过诱导可证实其成功分化为脂肪细胞和成骨细胞;反转录PCR结果显示,5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞在培养7,14,21 d,各组细胞牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白的mR NA表达增加,伴随细胞外基质磷酸糖蛋白表达下调;培养至28 d,行矿化结节检测发现牙髓干细胞向成牙本质细胞成功矿化,可见红染的矿化结节。结果证实,5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠诱导培养的牙髓干细胞可成功分化为成牙本质细胞,并下调细胞外基质磷酸糖蛋白mR NA的表达,同时上调牙本质基质蛋白1及牙本质涎蛋白mR NA的表达。

关键词：干细胞细胞分化牙髓组织工程分化牙髓干细胞牙本质基质蛋白1 细胞外基质磷酸糖蛋白牙本质涎蛋白 β-甘油磷酸钠成牙本质细胞诱导矿化矿化结节黑龙江省自然科学基金

Krüpple样因子5在成牙本质细胞中的表达及临床意义

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上海口腔医学 2017年第6期26卷 582-585页

作者：杜建新胡玮山东省淄博市中心医院口腔科山东淄博255000

目的 :研究转录因子Krüpple样因子5(Krüpple-like factor 5,KLF5)在人牙髓-牙本质复合体中的表达,探讨其在成牙本质细胞分化及牙本质形成过程中的作用。方法:应用免疫组织化学方法检测KLF5在人牙髓-牙本质复合体中及牙髓细胞矿化诱导... 详细信息

目的 :研究转录因子Krüpple样因子5(Krüpple-like factor 5,KLF5)在人牙髓-牙本质复合体中的表达,探讨其在成牙本质细胞分化及牙本质形成过程中的作用。方法:应用免疫组织化学方法检测KLF5在人牙髓-牙本质复合体中及牙髓细胞矿化诱导过程中的表达,Western印迹法检测KLF5在成牙本质细胞分化过程中的表达变化。采用SPSS17.0软件包对实验结果进行单因素方差分析和Tukey检验。结果 :在正常及龋坏牙中,KLF5表达于人成牙本质细胞和成牙本质样细胞,而在牙本质及前期牙本质中无表达。细胞免疫组织化学结果显示,在矿化诱导0、7、14 d的人牙髓细胞中,KLF5在细胞核中呈强阳性表达。Western印迹结果显示,随着矿化诱导时间的延长,KLF5蛋白表达量逐渐增加。诱导14~21 d时,KLF5表达量增加最显著。结论:KLF5可能参与成牙本质细胞分化及牙本质的形成过程。

关键词： Krüpple样因子5, 牙髓-牙本质复合体, 成牙本质细胞

人牙髓细胞体外培养及向成牙本质细胞的诱导分化

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中国组织工程研究与临床康复 2007年第11期11卷 2005-2008页

作者：赵炬滁州市中西医结合医院口腔科安徽省滁州市239000

目的:观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中碱性磷酸酶的表达和矿化结节形成能力,建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系。方法:实验于2004-07/2005-07在中山大学光华口腔医学院完成。利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴... 详细信息

目的:观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中碱性磷酸酶的表达和矿化结节形成能力,建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系。方法:实验于2004-07/2005-07在中山大学光华口腔医学院完成。利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定,取第3代牙髓细胞,胰酶消化后进行细胞计数,连续观察7d,绘制生长曲线。第3代牙髓细胞,使用矿化诱导液诱导其向成牙本质细胞样细胞分化,观察细胞形态改变和碱性磷酸酶活性变化,用Von kossa染色法观察诱导后的细胞形成矿化结节的能力。结果:①获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明为中胚层来源的细胞。②诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期;3周左右开始有细胞结节形成,周围细胞呈放射状排列,部分细胞出现细长突起并呈极性排列。4周左右细胞团中央Von Kossa染色为阳性。③与未诱导的细胞相比,矿化诱导开始3周碱性磷酸酶活性逐渐升高,但到第4周后活性有所降低。结论:实验成功建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系,所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能,是研究成牙本质细胞的较好模型。

关键词：牙髓细胞成牙本质细胞碱性磷酸酶

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TLR9在成牙本质细胞中的表达

口腔医学研究 2010年第4期26卷 464-466页

作者：胡楠何文喜王玮李鹏余擎第四军医大学口腔医学院牙体牙髓病科陕西西安710032

目的:研究成牙本质细胞中TLR9、DSPP基因表达特征及信号转导途径。方法:采用RT-PCR检测TLR9在小鼠牙髓组织中及TLR9、DSPP在成牙本质细胞系中的表达。用CpGODN-A和CpGODN-B刺激细胞,在时间梯度0、3、6、9、12、24h,检测TLR9、DSPP基因... 详细信息

目的:研究成牙本质细胞中TLR9、DSPP基因表达特征及信号转导途径。方法:采用RT-PCR检测TLR9在小鼠牙髓组织中及TLR9、DSPP在成牙本质细胞系中的表达。用CpGODN-A和CpGODN-B刺激细胞,在时间梯度0、3、6、9、12、24h,检测TLR9、DSPP基因的表达特征。结果:TLR9mRNA在小鼠牙髓组织中有表达。TLR9、DSPPmRNA在成牙本质细胞中都有显著的表达,在CpGODN刺激下显著上调,在6h处于峰值。结论:TLR9在成牙本质细胞中有表达;TLR9的特异性表达对DSPP基因表达量有影响。

关键词： Toll样受体9(TLR9) 牙本质涎磷蛋白(DSPP) 成牙本质细胞

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永生化人成牙本质细胞样细胞系的生物学特征

现代口腔医学杂志 2006年第1期20卷 38-40页

作者：王捍国肖明振赵守亮郝建军余擎第四军医大学口腔医学院西安710032

目的明确永生化人成牙本质细胞样细胞系hTERT-hOd-l的生物学特征。方法在连续体外培养过程中,观察细胞的形态学特征和生长增殖特征并与人成牙本质细胞样细胞比较。结果细胞形态为成纤维细胞样,细胞器发达,生长增殖活跃,具有克隆形成能... 详细信息

目的明确永生化人成牙本质细胞样细胞系hTERT-hOd-l的生物学特征。方法在连续体外培养过程中,观察细胞的形态学特征和生长增殖特征并与人成牙本质细胞样细胞比较。结果细胞形态为成纤维细胞样,细胞器发达,生长增殖活跃,具有克隆形成能力。结论hTERT-hOd-l保持了人成牙本质细胞样细胞的生物学特征。

关键词：成牙本质细胞生物学细胞系

SonicFill超声树脂对大鼠成牙本质细胞和牙髓微血管的影响

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中国组织工程研究 2016年第16期20卷 2369-2375页

作者：赵千宁王健平佟玮玮苏丹余彦衡佳木斯大学附属口腔医院黑龙江省佳木斯市154002

背景:SonicFill超声树脂在机械性能上优于传统光固化复合树脂充填材料,但其对牙髓成牙本质细胞和牙髓微血管的影响目前尚不清楚。目的:通过组织学方法观察SonicFill超声树脂对大鼠牙髓成牙本质细胞及牙髓微血管的影响。方法:实验选择Wis... 详细信息

背景:SonicFill超声树脂在机械性能上优于传统光固化复合树脂充填材料,但其对牙髓成牙本质细胞和牙髓微血管的影响目前尚不清楚。目的:通过组织学方法观察SonicFill超声树脂对大鼠牙髓成牙本质细胞及牙髓微血管的影响。方法:实验选择Wistar大鼠25只,在大鼠的第一和第二磨牙中选取96颗牙齿作为研究对象,随机分为,2组SonicFill超声树脂组和Filtek Z350纳米树脂组,每组48颗实验牙,分为7 d和30 d两个实验周期。另外随机选取5颗非实验牙,不干预,作为正常空白对照。选择上颌第一、二磨牙牙合面制备Ⅰ类窝洞,分别采用SonicFill超声树脂和Filtek Z350纳米树脂进行填充。于充填后7,30 d,墨汁灌注处死大鼠,取牙齿标本,观察牙髓的成牙本质细胞及牙髓微血管的扩张。结果与结论:①充填后7 d:两组均出现相似的牙髓组织改变,表现为牙髓轻度炎症反应,部分标本可见接近洞底牙髓组织中散在的炎症细胞浸润,多数标本可见成牙本质细胞排列紊乱,偶见空泡变性,牙髓微血管有扩张现象。②充填后30 d:SonicFill超声树脂组成牙本质细胞排列基本恢复正常,炎性反应消退,牙髓微血管无扩张,基本恢复正常;Filtek Z350纳米树脂组成牙本质细胞排列紊乱现象减少,炎性反应减轻,牙髓微血管扩张增粗现象减少。③结果表明,两种树脂对成牙本质细胞和牙髓微血管都会产生一定的影响,所产生的影响相似且都较小。

关键词：大鼠 Wistar 牙科树脂类自固化组织工程生物材料口腔生物材料 SonicFill超声树脂 Filtek Z350纳米树脂 Wistar大鼠模型成牙本质细胞牙髓微血管

健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中MMP-2和MMP-9的活性

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中国生物制品学杂志 2008年第8期21卷 669-671页

作者：王晓春梁景平郭炳诗张秀丽哈尔滨医科大学附属四院口腔内科哈尔滨150001 上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔内科上海市口腔医学研究所上海200011 中国科学院上海生命科学研究院上海交通大学医学院健康科学研究所上海200031 上海市口腔医学研究所上海市口腔医学重点实验室上海200011

目的比较健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性,以探讨MMP-2和MMP-9在龋病发病机制中的作用。方法培养健康牙齿和龋齿成牙本质细胞,利用酶谱分析细胞培养上清中MMP-2和MMP-9的活性。结... 详细信息

目的比较健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性,以探讨MMP-2和MMP-9在龋病发病机制中的作用。方法培养健康牙齿和龋齿成牙本质细胞,利用酶谱分析细胞培养上清中MMP-2和MMP-9的活性。结果龋齿组中MMP-2和MMP-9的活性显著高于健康组。结论MMP-2和MMP-9在健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中的活性不同,提示MMPs可能在龋病的进展过程中发挥作用。

关键词：成牙本质细胞基质金属蛋白酶活性龋病