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HEMA对人牙髓细胞、成牙本质样细胞中MMPs表达的影响与调控

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HEMA对人牙髓细胞、成牙本质样细胞中MMPs表达的影响与调控

作者：孙素昆明医科大学

学位级别：硕士

HEMA是牙本质粘接系统中重要的、分子量最小的亲水性单体,通过牙本质分子筛特性易于渗入HL内部,介导亲水性牙本质胶原与疏水性树脂材料结合。使用含HEMA的全酸蚀粘接系统时,其HEMA可渗入酸蚀后的脱矿牙本质中,防止胶原纤维塌陷,客观上... 详细信息

HEMA是牙本质粘接系统中重要的、分子量最小的亲水性单体,通过牙本质分子筛特性易于渗入HL内部,介导亲水性牙本质胶原与疏水性树脂材料结合。使用含HEMA的全酸蚀粘接系统时,其HEMA可渗入酸蚀后的脱矿牙本质中,防止胶原纤维塌陷,客观上维护了粘接界面的稳定,在生物机械力学方面具有较大的优势。但是,位于粘接界面以下的牙髓牙本质复合体具有的特殊结构,即近髓端的牙本质小管存在的牙髓神经末梢易受粘接单体刺激。混合层内的粘接剂长期与牙本质密切接触,其中的未聚合单体可通过牙本质小管渗透到牙髓腔,接触髓腔表层的成牙本质细胞层及深层的牙髓细胞。此外,残余单体的析出不仅降低了修复材料的机械性能,且易对材料生物相容性产生不良影响。目前,针对牙本质粘接单体HEMA对人牙髓细胞及成牙本质样细胞中MMPs表达的影响鲜见报道。因此,本研究选取牙本质粘接系统中常用的基质单体HEMA,作用于人牙髓细胞和由牙髓细胞定向诱导分化的成牙本质样细胞,检测上述细胞中MMP-2、-9的表达,为树脂材料与牙髓牙本质复合体中MMPs之间的相互关系提供实验依据,为寻求可靠、有效地防止牙本质粘接界面退变,提高粘接耐久性的方法及牙髓组织的修复再生研究奠定基础。目的：研究牙本质粘接单体HEMA对人牙髓细胞、成牙本质样细胞中MMP-2、-9表达调控的影响。方法：组织块法体外原代培养获得人牙髓细胞,以含不同浓度HEMA的DMEM培养基与第3-5代人牙髓细胞共同培养,MTT检测HEMA作用于牙髓细胞24、48和72 h的增殖情况,通过倒置荧光显微镜分析观察经不同浓度的HEMA处理48 h后细胞形态变化;然后,Transwell检测在非毒性条件下以100.400 μg/ml的HEMA处理牙髓细胞48 h后,观察其迁移数量,按同样处理方法,Western Blot检测牙髓细胞中MMP-2、-9的定量表达;最后,将牙髓细胞经诱导分化液培养3-4周, RT-PCR检测DSPP、BSP、ALP的基因表达情况,牙髓细胞成功诱导分化为成牙本质样细胞后,利用明胶酶谱法检测不同浓度HEMA对成牙本质样细胞中MMP-2、-9活性表达的影响。结果：HEMA在体外一定程度上抑制牙髓细胞的增殖,并呈时间浓度依赖性,24 h组的细胞活力值均显著高于48 h和72 h组,不同时间点的细胞活力值均明显低于各自空白对照(P细胞经HEMA处理48 h后,空白对照组细胞生长状态良好,随着浓度增加,细胞密度明显减低,生长受到抑制,浓度到800 μg/ml时,细胞开始变为圆形,有凋亡迹象,出现细胞碎片,1500μg/ml时可见大量细胞死亡,数目稀少,出现严重变形;含100、400μg/ml HEMA的DMEM培养基作用于牙髓细胞后,与空白对照组相比,迁移细胞数目明显减少(P细胞成功诱导分化为成牙本质样细胞,HEMA对其中MMP-2、-9的活性具有抑制作用,孵育24 h后呈剂量依赖性抑制,其中浓度为10%HEMA呈现较强的抑制作用,但MMP-2的酶原仍未完全被抑制,采用线性回归分析HEMA对MMP-2及MMP-9的抑制作用,决定系数为r2=0.921(p牙本质复合体中MMPs活性的抑制作用表现为两方面的临床意义：(1)牙髓细胞、成牙本质细胞与牙本质具有同源性MMPs,HEMA对其中MMPs活性的抑制,可能会保护牙本质粘接操作过程中或粘接术后I型胶原的降解,客观上维护了树脂牙本质粘接界面的稳定,具有提高牙本质粘接耐久性的潜能;(2)对牙髓细胞中MMPs表达抑制的同时,限制了牙髓细胞向成牙本质细胞的迁移,进而影响了修复性牙本质的形成。因此,含HEMA的牙本质粘接系统在临床应用中是一把双刃剑,维持粘接界面稳定性的同时又影响了修复性牙本质的形成。

关键词： HEMA 牙髓细胞成牙本质样细胞迁移 MMPs

小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为成牙本质样细胞体外实验研究

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小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为成牙本质样细胞体外实验研究

作者：刘哲南昌大学

学位级别：硕士

目的:明确DNCP微环境下小鼠iPS细胞向成牙本质样细胞分化的效果及探讨BMPs对诱导分化过程的影响及可能机制。方法:实验第一部分:将购买的小鼠iPS(OSKM体系)复苏、与小鼠MEF共培养环境下用iPS细胞基础培养基进行扩增、传代,继而用iPS细... 详细信息

目的:明确DNCP微环境下小鼠iPS细胞向成牙本质样细胞分化的效果及探讨BMPs对诱导分化过程的影响及可能机制。方法:实验第一部分:将购买的小鼠iPS(OSKM体系)复苏、与小鼠MEF共培养环境下用iPS细胞基础培养基进行扩增、传代,继而用iPS细胞分化培养基悬滴培养3d后转入低黏附培养皿中悬浮培养制备拟胚体。用倒置显微镜观察iPS克隆团的形态特点和拟胚体的形成过程。悬浮培养2d免疫荧光法检测拟胚体多能干细胞标志性基因Oct-4、Sox-2的表达。实验第二部分:从小鼠离体牙中提取DNCP,采用MTT法确定DNCP最佳作用浓度,各组实验浓度设定为100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml,10000ng/ml。收集拟胚体,参照MTT实验结果设计四组:自分化对照组、添加500ng/ml的DNCP、添加500ng/mlDNCP+50ng/ml的Noggin、添加500ng/mlDNCP+25ng/ml BMP-2+25ng/ml BMP-4四组定向分化,连续培养10d,运用qRT-PCR检测各组成牙本质细胞特异性标志物DMP-1、DSPP及相关通路基因Msx-1表达。运用Western-blot检测各组p38和Smad-4蛋白表达及磷酸化水平。结果:共培养环境下小鼠iPS细胞克隆团样生长,克隆团呈小的球形,细胞形态较一致,排列紧密。悬滴培养3d和悬浮培养2d形成拟胚体的散在分布,形态均一,体积较大,实性型,可见细胞多形性。第5d拟胚体免疫荧光实验显示Oct-4和Sox-2阳性表达。MTT结果示500ng/mlDNCP处理组小鼠iPS细胞具有最佳的存活率和增殖能力。QRT-PCR结果:经DNCP诱导10d后,小鼠iPS细胞阳性表达DSPP、DMP-1,添加Noggin后,DSPP、DMP-1表达相较于DNCP组减少(P细胞向成牙本质样细胞分化。BMP/Smad和BMP/p38信号通路在其中发挥了重要作用。

关键词：牙本质非胶原蛋白骨形成蛋白小鼠诱导式多能干细胞成牙本质样细胞

脂磷壁酸诱导人成牙本质样细胞炎症微环境的机制研究

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中华口腔医学研究杂志（电子版） 2017年第5期11卷 257-265页

作者：孟润莎莫泽欢徐琼中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院广东省口腔医学重点实验室广州510055

目的研究脂磷壁酸(LTA)诱导的体外培养人成牙本质样细胞(hOB)炎症反应及其上游信号通路的作用机制。方法从人牙髓组织中分离并培养hOB,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测成牙本质细胞标志物,对hOB进行鉴定,... 详细信息

目的研究脂磷壁酸(LTA)诱导的体外培养人成牙本质样细胞(hOB)炎症反应及其上游信号通路的作用机制。方法从人牙髓组织中分离并培养hOB,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测成牙本质细胞标志物,对hOB进行鉴定,结果采用独立样本t检验;采用Western blot和免疫荧光法检测hOB中TLR2的表达,结果采用t检验;以10μg/ml LTA刺激hOB,炎性因子蛋白芯片检测42种炎性因子蛋白的表达,实时荧光定量PCR及酶联免疫吸附法(ELISA)对白细胞介素6(IL-6)和IL-8的表达进行验证,Western blot检测不同时间点LTA刺激下TLR2的表达情况,结果采用单因素方差分析;Western blot检测LTA对核转录因子(NF-κB)和活化的丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路关键蛋白IKKα/β、IκBα、p65、ERK、JNK及p38磷酸化程度的影响,结果采用方差分析。结果分离培养获得的hOB中牙本质基质蛋白1(DMP1;t_(mRNA)=6.206,P_(mRNA)=0.0024;t_(蛋白)=11.48,P_(蛋白)=0.001)、牙本质涎磷蛋白(DSPP;t_(mRNA)=4.284,P_(mRNA)=0.0155;t_(蛋白)=34.93,P_(蛋白)细胞(hDPC)高,提示已成功获得hOB。炎性因子蛋白芯片结果显示,LTA刺激后14种炎性因子均升高(P<0.05),其中IL-6和IL-8升高最为明显且经实时荧光定量PCR(FIL-6=40.62,PIL-6<0.0001;FIL-8=1768,PIL-8<0.0001)和ELISA(FIL-6=380.9,PIL-6<0.0001;FIL-8=252.5,PIL-8<0.0001)验证。10μg/ml LTA刺激16 h后,hOB中TLR2蛋白表达显著性升高,差异具有统计学意义(F=3.175,P=0.0469)。LTA刺激可使NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白IKKα/β(F=28.7,P<0.0001)、IκBα(F=106.3,P<0.0001)、p65(F=44.58,P<0.0001)、ERK(F=45.49,P<0.0001)、JNK(F=12.43,P=0.0007)及p38(F=28.28,P<0.0001)磷酸化程度升高。结论 LTA可能通过TLR2/NF-κB/MAPK信号通路促进hOB释放炎性因子。

关键词：成牙本质样细胞脂磷壁酸炎症微环境机制

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诱导成牙本质样细胞在体内外的矿化研究

牙体牙髓牙周病学杂志 2003年第8期13卷 423-425,T001页

作者：邓蔓菁金岩史俊南聂鑫刘源赵宇赵守亮 Smith AJ 第四军医大学口腔医学院陕西西安710032 英国伯明翰大学牙科学院口腔生物系

目的 :人早期胚胎颌突外胚间充质细胞在体外能被诱导分化为成牙本质样细胞 ,表达牙本质特异的涎磷蛋白。本研究探讨该诱导分化细胞在体内外矿化的可能。方法 :转化生长因子 - β1(TGF - β1)和牙本质非胶原蛋白 (DNCP)作用于三维培养的... 详细信息

目的 :人早期胚胎颌突外胚间充质细胞在体外能被诱导分化为成牙本质样细胞 ,表达牙本质特异的涎磷蛋白。本研究探讨该诱导分化细胞在体内外矿化的可能。方法 :转化生长因子 - β1(TGF - β1)和牙本质非胶原蛋白 (DNCP)作用于三维培养的外胚间充质细胞 ,诱导 10d ,然后将诱导的成牙本质样细胞接种于裸鼠皮下 ,X线照相 ,组织切片 ,HE染色 ,观察细胞在体内的矿化情况。同时消化细胞 ,培养于矿化液中 ,观察细胞在体外的矿化能力。结果 :8周后 ,裸鼠皮下接种的胶原细胞密度明显高于对照组。 5周 ,胶原内的细胞为单极长突起 ;8周时 ,细胞周围可见牙本质样基质结构沉积。矿化液中的细胞 3d出现复层生长 ,2 1d ,VonKossa染色阳性。结论 :诱导的成牙本质样细胞在体内可以形成类似牙本质样基质 ,在体外能形成矿化结节 ,为有功能的终末分化的成牙本质细胞。

关键词：成牙本质样细胞矿化培养

转化生长因子β3诱导人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞的分化（英文）

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中国组织工程研究 2014年第23期18卷 3745-3750页

作者：周慧林锦梅任飞刘建平章锦才徐平平杨勤陈晓春珠海市口腔医院广东省珠海市519000 广州医科大学广东省广州市510182 广东省口腔医院.南方医科大学附属口腔医院广东省广州市510260 中山大学孙逸仙纪念医院广东省广州市510120

背景:转化生长因子β3与肝素联合作用后对人乳牙牙髓干细胞的增殖和矿化能力的作用目前仍有待研究。目的:探讨转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化的作用。方法:采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,获得人乳牙牙髓干... 详细信息

背景:转化生长因子β3与肝素联合作用后对人乳牙牙髓干细胞的增殖和矿化能力的作用目前仍有待研究。目的:探讨转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化的作用。方法:采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,获得人乳牙牙髓干细胞;对体外培养的第3代人乳牙牙髓干细胞单独加入25μg/L重组转化生长因子β3、10 U/mL肝素,或者二者联合进行培养;通过Q-PCR和Western-blotting方法,分别检测乳牙牙髓干细胞中牙本质涎磷蛋白基因及牙本质涎蛋白表达的情况;通过碱性磷酸酶试剂盒检测乳牙牙髓干细胞碱性磷酸酶活性的改变。结果与结论:乳牙牙髓干细胞在诱导体系中生长状态良好。25μg/L转化生长因子β3+10 U/mL肝素联合作用组的碱性磷酸酶活性明显增强,与转化生长因子β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比差异有显著性意义(P牙本质涎磷蛋白mRNA和蛋白表达均明显升高。结果可见在转化生长因子β3与肝素联合作用的诱导下,可促进乳牙牙髓干细胞分化为成牙本质样细胞。

关键词：干细胞分化人乳牙牙髓干细胞转化生长因子β3 肝素成牙本质样细胞

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小鼠胚胎干细胞向成牙本质样细胞的诱导分化

上海口腔医学 2006年第6期15卷 653-656页

作者：江中明季佩红刘军唐月军李生娇李文林第二军医大学长海医院口腔科上海200433 上海市杨浦区牙防所上海200082 第二军医大学细胞生物教研室上海200433

目的探讨胚胎干细胞(ES细胞)向成牙本质样细胞诱导分化的方法。方法首先通过悬浮培养的方式,将ES细胞诱导分化形成拟胚体,然后将拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞通过Transwell培养系统共培养,研究拟胚体细胞向成牙本质样细胞的分化情况。结... 详细信息

目的探讨胚胎干细胞(ES细胞)向成牙本质样细胞诱导分化的方法。方法首先通过悬浮培养的方式,将ES细胞诱导分化形成拟胚体,然后将拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞通过Transwell培养系统共培养,研究拟胚体细胞向成牙本质样细胞的分化情况。结果RT-PCR结果显示,拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞共培养10d后,可检测到成牙本质细胞的特征性分子——牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达;共培养15d后,表达有所增强。而单独培养的拟胚体细胞,则始终未检测到DSPP的表达。结论通过与牙髓成纤维细胞共培养,可以促进胚胎干细胞向成牙本质样细胞分化。

关键词：胚胎干细胞成牙本质样细胞分化共培养

DNCP诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的浓度优化

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重庆医学 2009年第12期38卷 1464-1465页

作者：邓蔓菁陈小红刘鲁川安建平匡桂英第三军医大学大坪医院野战外科研究所口腔科重庆400042

目的探讨牙本质非胶原蛋白(DNCP)诱导大鼠面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的最适浓度。方法取妊娠12.5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,DNCP诱导浓度分别为10、50、100、200、500、1 000μg/mL,观察细胞形态变化,诱导6d... 详细信息

目的探讨牙本质非胶原蛋白(DNCP)诱导大鼠面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的最适浓度。方法取妊娠12.5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,DNCP诱导浓度分别为10、50、100、200、500、1 000μg/mL,观察细胞形态变化,诱导6d后采用定量RT-PCR检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的表达。结果6d后除10μg/mL组和1000μg/mL组外,其他诱导组细胞出现极性改变,部分细胞出现平行排列趋势;细胞表达DSPP和DMP1,以200μg/mL组最强,500μg/mL组和200μg/mL组表达量相当,而1 000μg/mL组细胞死亡。结论在DNCP诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中过低浓度不利于成牙本质细胞的分化,而过高浓度则引起细胞死亡。200μg/mL是较为合适的有效诱导浓度。

关键词：牙本质非胶原蛋白面突外胚间充质细胞成牙本质样细胞诱导分化浓度

经典Wnt通路调节骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化

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实用口腔医学杂志 2012年第6期28卷 673-676页

作者：董金山郝靖惠段晴月杨博白庆霞张艳陆群第四军医大学口腔医院牙体牙髓科西安710032

目的:探讨经典Wnt通路在骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用,以期为临床治疗牙髓损伤提供新策略。方法:用牙胚细胞条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化,培养液内分别加入外源性Wnt激活剂Wnt3a/抑制剂DKK-1... 详细信息

目的:探讨经典Wnt通路在骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用,以期为临床治疗牙髓损伤提供新策略。方法:用牙胚细胞条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化,培养液内分别加入外源性Wnt激活剂Wnt3a/抑制剂DKK-1,检测经典Wnt通路中β-catenin、LEF1、TCF4及成牙本质样细胞特异表达物DSPP、DMP-1变化。结果:骨髓间充质干细胞经Wnt激活剂/抑制剂处理后,胞浆内β-catenin水平明显上升/下降,其下游核内转录因子LEF1、TCF4基因水平明显上升/下降,而细胞内DSPP、DMP-1的表达明显降低/升高。结论:Wnt信号通路抑制骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化。

关键词：骨髓间充质干细胞成牙本质样细胞 Wnt β-catenin通路

转化生长因子β3联合肝素在人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用

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实用医学杂志 2014年第12期30卷 1887-1890页

作者：任飞周慧刘建平章锦才徐平平杨勤陈晓春广东省口腔医院南方医科大学附属口腔医院广州市510260 广东省珠海市口腔医院 519000 中山大学孙逸仙纪念医院广州市510120

目的:探讨转化生长因子β3(TGF-β3)诱导人乳牙牙髓干细胞(SHED)向成牙本质样细胞分化的能力。方法:采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,获得SHED;对体外培养的第3代SHED分别单独加入25 ng/mL的重组TGF-β3,或与肝素联合进行培养;通过Q-... 详细信息

目的:探讨转化生长因子β3(TGF-β3)诱导人乳牙牙髓干细胞(SHED)向成牙本质样细胞分化的能力。方法:采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,获得SHED;对体外培养的第3代SHED分别单独加入25 ng/mL的重组TGF-β3,或与肝素联合进行培养;通过Q-PCR和Western-blotting方法,分别观察SHED表达成牙本质细胞特异性标志物-牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因及其基因表达产物-牙本质涎蛋白(DSP)的情况;通过碱性磷酸酶(AKP)试剂盒检测SHED的AKP活性的改变;细胞爬片行免疫化学染色和茜素红染色。结果:SHED在诱导体系中生长状态良好。25 ng/mL TGF-β3联合10 U/mL肝素作用组的AKP活性明显增强,与TGF-β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比差异具有统计学意义(P成牙本质样细胞。

关键词：人乳牙牙髓干细胞转化生长因子β3 肝素成牙本质样细胞