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家蚕Hippo通路成员的全基因组鉴定与分析

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家蚕Hippo通路成员的全基因组鉴定与分析

作者：宋春暖西南大学

学位级别：硕士

家蚕(Bombyx mori)属鳞翅目蚕蛾科昆虫,是迄今唯一被人类完全驯化并大规模饲养的经济昆虫。家蚕具有生长周期短、遗传背景清楚、蛋白质翻译后修饰系统、丝蛋白高效合成和分泌能力、饲养成本低和可规模化饲养等优点,是继果蝇之后的重要... 详细信息

家蚕(Bombyx mori)属鳞翅目蚕蛾科昆虫,是迄今唯一被人类完全驯化并大规模饲养的经济昆虫。家蚕具有生长周期短、遗传背景清楚、蛋白质翻译后修饰系统、丝蛋白高效合成和分泌能力、饲养成本低和可规模化饲养等优点,是继果蝇之后的重要模式昆虫之一。随着家蚕全基因组序列的测定,在基因组水平上加快鉴定和解析家蚕重要经济性状和生物学性状相关基因,对于进一步提升家蚕作为鳞翅目昆虫模式的研究价值,促进以基因改造利用为主线的蚕品种改良和新型遗传素材创制等具有深远意义。器官大小是多细胞生物体的重要生物学性状,对于一些经济动物而言,器官大小还决定着其产量或品质性状。Hippo通路是迄今发现的一条控制动物器官大小的主要信号通路。自1995年在果蝇中发现Hippo通路以来,有关Hippo通路的研究取得了丰富进展,同时也显示了Hippo通路复杂而多样的调控机制。本论文以家蚕全基因组数据和芯片表达谱数据为基础,利用生物信息学方法,对家蚕Hippo通路成员进行全基因组鉴定,并对核心成员BmHpo进行克隆和表达分析,取得的主要结果如下:1.家蚕Hippo通路核心成员的鉴定与分析利用序列同源比对方法,自家蚕中鉴定了四个Hippo通路核心成员BmHpo、BmMats、BmSav和BmWts,其中BmHpo和BmWts都含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域,BmSav含有四个WW结构域,BmMats含有Mob1hocein结构域,这四个成员的蛋白结构域与果蝇Hippo通路核心成员的蛋白结构域类似,表明其在功能或作用方式上亦类似。BmHpo在卵巢和马氏管中的表达量相对较高,BmMats在脂肪体中表达量最高,BmWts和BmSav在变态发育阶段的雌雄个体中具有类似的表达模式。2.家蚕Hippo通路上游成员的鉴定与分析利用序列同源比对方法,自家蚕中鉴定了49个上游成员。在47个具有组织表达信息的成员中,BmMop、BmJub、BmCrb、BmCi、BmSmurf、BmLft、Bm Mer为组织特异表达基因;BmEx、BmZyx、BmFexL7、BmDpp、BmDlg、BmRassf、BmSTRIPAK、BmPP1、BmMop、Bmβ-cat、BmSlmb、BmDREF、BmCK2、Bm14-3-3、BmCsk等成员在卵巢或精巢中高量表达,推测他们可能参与调控家蚕精子及卵子的发生。同时这些高表达成员在丝腺组织中也有高量表达,暗示其可能在家蚕丝腺生长发育过程中发挥调控作用。3.家蚕Hippo通路下游成员的鉴定与分析利用序列同源比对方法,自家蚕中鉴定了包括转录共激活因子Bm Yki在内的10个下游成员,其中BmYki在卵巢和前、后部丝腺中表达量相对较高,BmCbt、BmBrm和BmWbp2在丝腺、精巢和卵巢中表达量较高,Bm Mad在精巢和脂肪体中的表达量最高,BmMor在体壁和脂肪体中表达量较高,BmTsh在前部丝腺和后部丝腺表达相对较高,BmHth在雌蚕的后部丝腺和雄蚕中表达量相对较高,BmSdBP在雌蚕的前部及后部丝腺表达量相对较高,BmSd在雄蚕的脂肪体中相对表达较高。BmYki蛋白含有两个WW结构域,含有高度保守的色氨酸残基,能特异识别并结合富含脯氨酸的蛋白基序和磷酸化的氨酸/色氨酸-脯氨酸肽段。另外9个下游成员的蛋白结构域与果蝇中的相应下游成员类似,推测家蚕Hippo通路下游成员在通路中的功能或作用方式与果蝇类似,即BmYki作为最关键的下游成员,在调控下游靶基因表达过程中起核心作用,BmSd、BmTsh、BmHth、BmMad、BmCbt、BmBrm、BmMor、BmWbp2和BmSdBP等9个成员通过与BmYki结合,协同BmYki入核调控下游靶基因。4.家蚕Hippo通路核心成员BmHpo的克隆及表达分析利用RT-PCR技术对家蚕Hippo通路核心基因BmHpo进行了扩增和克隆。BmHpo基因的CDS序列全长1 479 bp,编码492个氨基酸;BmHpo基因编码的蛋白含有一个Hpo家族共有的Ster I-20 family S保守结构域。亚细胞定位结果显示BmHpo定位在细胞质中,与果蝇和哺乳动物中Hpo基因的定位结果一致。组织和时期转录表达分析表明,BmHpo基因在家蚕各组织中的表达水平较低,在精巢和头部表达量相对较高;其在家蚕整个发育时期表达量普遍较低,这与Hippo通路属于细胞生长抑制性信号通路吻合。5.三种CRISPR/Cas系统的构建及转录表达验证根据从Addgene共享质粒数据库下载的三种CRISPR/Cas系统的相应序列,经密码子优化后合成了带有入核信号的SpCas9、SaCas9和AsCpf1基因序列以及相应的gRNA表达载体序列,构建了以家蚕肌动蛋白Actin4(A4)为启动子的3个Cas表达载体pUC57[A4-SpCas9-Ser1p

关键词：家蚕 Hippo通路成员鉴定表达特征基因克隆

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龙眼漆酶家族成员全基因组结构与功能分析

应用与环境生物学报 2018年第4期24卷 833-844页

作者：徐小萍陈晓慧吕科良陈旭陈裕坤林玉玲赖钟雄福建农林大学园艺植物生物工程研究所

为了解龙眼漆酶（DlLAC）家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼基因组LAC基因成员鉴定,蛋白结构域及特性、启动子顺式作用元件、分子进化树分析、体胚发生过程和组织器官特异表达的FPKM分析以及可能互作的mi RNA预测.结果... 详细信息

为了解龙眼漆酶（DlLAC）家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼基因组LAC基因成员鉴定,蛋白结构域及特性、启动子顺式作用元件、分子进化树分析、体胚发生过程和组织器官特异表达的FPKM分析以及可能互作的mi RNA预测.结果显示：DlLAC家族基因包含42个基因成员,分为7大类;基因家族成员内含子数量1-8个不等,以5个为主,其中DlLAC15-1中存在600 bp短串联重复序列;DlLAC蛋白结构域共存在5种类型,均属于铜蓝蛋白,以3个铜蓝氧化酶结构域为主;DlLAC蛋白均为分泌型蛋白,亚细胞定位预测在胞外,包含2个以上糖基化位点,具有多个保守的motif;5端调控序列预测分析,DlLAC可能具有多个转录起始位点;DlLACp启动子序列均包含大量非生物胁迫应激响应元件、胚乳特异表达元件及MYB结合位点,推测MYB可能通过DlLAC进而调控龙眼胚胎发育.DlLAC9-1p、DlLAC12p、DlLAC17-2p含黄酮类化合物合成调控的MYB结合位点,可能参与龙眼生长发育过程中种子成熟和果皮成色的色素合成途径;DlLAC家族成员可能参与不同体胚发育过程和不同组织器官形态建成.42个龙眼漆酶成员共有28个受miRNA调控,13个成员受miR397调控,可能与木质素合成相关,8个成员受miR1535调控.非miR397调控的成员可能发挥其他重要的生物学功能.本研究表明,DlLAC家族成员在龙眼生长发育过程中除了参与木质素合成以外,还可能参与胚胎发育、胚乳发育、色素合成、组织器官特异表达等重要生物学功能,表现其功能上的多样性.

关键词：龙眼漆酶家族成员鉴定功能分析 miRNA预测

龙眼UBP家族全基因组鉴定及其在外源胁迫下的表达分析

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浙江大学学报（理学版） 2023年第3期50卷 367-377,390页

作者：童宁张春渝许小琼陈晓慧申序赖钟雄福建农林大学园艺植物生物工程研究所福建福州350002

泛素特异蛋白酶(ubiquitin-specific protease,UBP)是去泛素化酶六大家族中最大的,广泛存在于真核生物中,保守性很高。UBP可通过去泛素化作用调节各种生物的生长发育。为了解龙眼(Dimocarpus longan Lour.)DlUBP基因家族的生物学功能及... 详细信息

泛素特异蛋白酶(ubiquitin-specific protease,UBP)是去泛素化酶六大家族中最大的,广泛存在于真核生物中,保守性很高。UBP可通过去泛素化作用调节各种生物的生长发育。为了解龙眼(Dimocarpus longan Lour.)DlUBP基因家族的生物学功能及其在龙眼体胚早期发生过程中的作用,基于第3代龙眼基因组数据库与转录组数据库,对DlUBP全基因组进行鉴定,分析其基因结构、蛋白质结构域、启动子顺式元件及构建系统进化树,并对DlUBP基因在脱落酸处理和干旱胁迫处理下的表达情况进行分析。结果显示,DlUBP家族共有18个成员,分为10个亚家族,其中最大的亚家族有4个成员;各成员的氨基酸数为369~1117个,内含子数为2~31个;在DlUBP启动子序列中存在大量光响应元件、厌氧诱导响应元件、激素响应元件,随着处理时间的增加,在脱落酸处理下,多数DlUBP基因的表达量呈降低趋势,在干旱胁迫处理下,有不少DlUBP基因的表达量升高,推测DlUBP基因在龙眼体胚早期参与脱落酸的调控并对干旱胁迫有应激反应。

关键词：龙眼 UBP基因成员鉴定表达情况

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龙眼GRF家族全基因组鉴定及表达模式

应用与环境生物学报 2020年第2期26卷 236-245页

作者：刘蒲东张舒婷陈晓慧苏立遥姚德恒李汉生张梓浩陈裕坤林玉玲赖钟雄福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002

生长调节因子(growth regulating factor,GRF)是植物体内特有的一种转录因子,在植物生长发育、渗透胁迫中发挥重要的作用.基于龙眼基因组和转录组数据,采用生物信息学分析的方法对龙眼GRF(DlGRF)家族成员进行鉴定命名;分析其基本理化性... 详细信息

生长调节因子(growth regulating factor,GRF)是植物体内特有的一种转录因子,在植物生长发育、渗透胁迫中发挥重要的作用.基于龙眼基因组和转录组数据,采用生物信息学分析的方法对龙眼GRF(DlGRF)家族成员进行鉴定命名;分析其基本理化性质、基因结构、蛋白结构域、启动子序列顺式作用元件;构建系统进化树、预测可能直接调控DlGRF的miRNAs;分析DlGRF家族在龙眼非胚性及胚性培养物、组织器官、光质与激素处理下的表达水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DlGRF的表达模式.结果显示,龙眼DlGRF家族包含9个成员,均含有QLQ和WRC保守结构域;包含2-5个外显子,以3个为主;分布于四大分支上,与甜橙、拟南芥GRF亲缘关系较近;DlGRF蛋白包含7个motif;启动子序列中包含众多光响应、激素应答、厌氧感应、胁迫响应及其他与生长发育相关的作用元件.转录组结果显示,DlGRF家族8个成员在球形胚阶段表达量高于其他阶段;各成员均在种子中有较高表达量,对蓝、白光及激素响应明显. qRT-PCR结果显示,DlGRF1-2、DlGRF2-1、DlGRF2-2、DlGRF4、DlGRF5-1及DlGRF7在球形胚阶段表达量最高;DlGRF1-1、DlGRF1-2、DlGRF2-2及DlGRF5-2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和赤霉素(GA3)等激素处理中表达上调.此外,DlGRF可能受miR396a调控,调控方式为裂解靶标.本研究表明DlGRF在进化过程中保守性较高,且可能受到蓝光和激素的诱导,参与龙眼非胚性及胚性培养物尤其是球形胚及种子发育形成的过程.(图6表3参42)

关键词：龙眼生长调节因子(GRF) 成员鉴定光质激素实时荧光定量PCR

龙眼BRI1基因家族的全基因组鉴定及光照响应表达

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应用与环境生物学报 2020年第1期26卷 125-134页

作者：李汉生孙刚陈晓慧姚德恒林玉玲赖钟雄三明学院资源与化工学院三明365004 福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002

为了解龙眼BRI1基因家族的生物学功能及响应光照机制,对其BRI1基因成员鉴定、基因结构、蛋白保守结构域、启动子顺式作用元件、互作miRNA预测、不同体胚发生阶段和不同组织器官的FPKM值及其响应光照表达模式等进行分析.结果表明:DlBRI1... 详细信息

为了解龙眼BRI1基因家族的生物学功能及响应光照机制,对其BRI1基因成员鉴定、基因结构、蛋白保守结构域、启动子顺式作用元件、互作miRNA预测、不同体胚发生阶段和不同组织器官的FPKM值及其响应光照表达模式等进行分析.结果表明:DlBRI1基因家族包含4个成员,分别命名为DlBRI1-1、DlBRI1-2a、DlBRI1-2b和***1是一种无内含子基因,无内含子基因在转录的过程中不需要经历内含子的剪切步骤,是响应外界因素的一种快速应答基因.龙眼BRI1蛋白家族为植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的一种,其在植物激素信号转导和非生物胁迫中具有重要调控作用.龙眼BRI1四个家族成员启动子均含有大量的光响应元件、激素应答元件、非生物胁迫响应元件,表明龙眼BRI1家族基因可能是连接光信号转导与激素信号转导的重要纽带.DlBRI1-3为miR390e的靶基因.FPKM值分析表明,DlBRI1-1和DlBRI1-3在体胚发生过程和不同组织部位中均呈现高表达,推测DlBRI1-1和DlBRI1-3可能在龙眼整个生长发育过程中起到更为关键的作用.荧光定量PCR结果推测,蓝光信号使得miR390的表达量显著减少,导致靶基因BRI1-3的表达量增加,从而影响油菜素内脂从属基因BZR1、转录因子PIF4,进而影响龙眼功能性代谢产物积累.本研究表明DlBRI1具有功能多样性,可能在龙眼响应光信号、激素信号、非生物胁迫及代谢调控中发挥作用.

关键词：龙眼 BRI1基因家族成员鉴定光照 miRNA预测表达

龙眼UGT家族全基因组鉴定、功能预测及表达模式

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应用与环境生物学报 2021年第6期27卷 1626-1635页

作者：刘蒲东张舒婷申序李晓斐赵桦张梓浩陈裕坤林玉玲陈振光王晶赖钟雄福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002 山西农业大学经济作物研究所汾阳032200

植物中糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases,UGTs)糖化各种植物激素和代谢物以应对生物和非生物胁迫.对龙眼UGTs(DlUGTs)家族进行全基因组鉴定,对各成员理化性质、系统发育进化树、基因结构、染色体定位、保守基序、全基因组共线性进... 详细信息

植物中糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases,UGTs)糖化各种植物激素和代谢物以应对生物和非生物胁迫.对龙眼UGTs(DlUGTs)家族进行全基因组鉴定,对各成员理化性质、系统发育进化树、基因结构、染色体定位、保守基序、全基因组共线性进行预测分析,并结合转录组对DlUGTs在龙眼体胚发育胚性愈伤组织(EC)、不完全胚性紧实结构(ICpEC)和球形胚(GE)3个阶段的表达模式进行分析.结果显示,DlUGTs家族共有167个成员.系统发育进化树分析发现这些成员分布于15个组中.蛋白保守基序分析发现所有成员均包含保守motif 1(PSPG-box)且同组成员的motif分布高度相似.对DlUGTs家族成员的基因结构进行分析,发现其内含子数目在0-4之间.启动子顺式作用元件分析发现,各成员启动子区包含众多响应生物与非生物胁迫的作用元件,如光、温、激素等.染色体定位分析发现DlUGTs家族成员分布在14条染色体上,33个成员定位在chr14.对DlUGTs在EC-ICpEC-GE阶段的表达模式分析发现共138(83%)个成员在3个阶段检测到表达量,其中7个成员在EC-ICpEC-GE阶段呈持续上调表达.本研究通过预测分析发现DlUGTs家族成员具备功能多样性,可能在龙眼应对胁迫、细胞代谢及体胚发育过程中发挥作用,结果可为UGT关键基因的进一步筛选和表征提供理论依据.

关键词：龙眼糖基转移酶成员鉴定功能预测表达模式

龙眼SAP-PPD-KIX-TPL信号途径基因家族的全基因组鉴定与表达模式

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应用与环境生物学报 2022年第2期28卷 440-450页

作者：韩婕陈晓慧申序李晓斐林玉玲吴鹏飞赖钟雄福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002 福建农林大学林学院福州350002

STERILE APETALA(SAP)可调控PPD-KIX-TPL转录抑制复合体的稳定性,从而调节器官大小.基于龙眼基因组数据库,对龙眼SAP-PPD-KIX-TPL信号途径的基因家族进行全基因组鉴定,分析龙眼SAP、PEAPOD(PPD)和TOPLESS(TPL)家族成员的基本理化性质、... 详细信息

STERILE APETALA(SAP)可调控PPD-KIX-TPL转录抑制复合体的稳定性,从而调节器官大小.基于龙眼基因组数据库,对龙眼SAP-PPD-KIX-TPL信号途径的基因家族进行全基因组鉴定,分析龙眼SAP、PEAPOD(PPD)和TOPLESS(TPL)家族成员的基本理化性质、基因结构及蛋白结构域、启动子顺式作用元件、蛋白互作网络、构建系统进化树;分析龙眼体胚发生过程及不同组织部位中的基因表达水平,并采用qRT-PCR检测体胚发生早期及不同激素处理下的表达模式.结果表明,DlSAP包含1个成员,具有WD40结构域,只有1个内含子.DlPPD包含7个成员,具有tify和CCT_2结构域,含有2-7个内含子,最保守基序为***包含6个成员,具有LisH、CTLH和WD40结构域,含有23-29个内含子,除motif7外,motif1-10中的剩余基序均保守.龙眼kinase-inducible domain interacting(KIX)家族包含8个成员,保守结构域为KIX.顺式作用元件预测表明,DlSAP、DlPPD和DlTPL启动子均包含大量光响应、激素应答和非生物胁迫响应元件.蛋白互作网络预测显示,SAP和PPD之间的互作关系较强,与TPL相关联的蛋白较多.qRT-PCR结果表明,DlSAP、DlTIFY4B和DlTPR2-1在球形胚阶段表达量最高;DlSAP、DlTIFY10B-1和DlTPR2-1在不同激素处理中均出现多种表达模式.总之,龙眼SAP-PPD-KIX-TPL信号途径的基因可能参与响应多种激素和非生物胁迫应答,也可能参与胚胎发育,具有多种生物学功能.(图9表2参33)

关键词：龙眼 SAP-PPD-KIX-TPL信号途径成员鉴定生物信息学分析实时荧光定量PCR

香蕉漆酶基因家族鉴定及低温胁迫下的表达分析

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园艺学报 2020年第5期47卷 837-852页

作者：刘彦英倪珊珊项蕾蕾陈裕坤赖钟雄福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002

为研究香蕉漆酶基因家族成员的功能,采用生物信息学方法鉴定香蕉漆酶基因成员,分析其低温胁迫下的表达情况,为香蕉抗寒研究提供理论依据。从香蕉A(Musa acuminata)基因组筛选了22条漆酶基因(MaLAC),从香蕉B(Musa balbisiana)基因组筛选... 详细信息

为研究香蕉漆酶基因家族成员的功能,采用生物信息学方法鉴定香蕉漆酶基因成员,分析其低温胁迫下的表达情况,为香蕉抗寒研究提供理论依据。从香蕉A(Musa acuminata)基因组筛选了22条漆酶基因(MaLAC),从香蕉B(Musa balbisiana)基因组筛选了11条漆酶基因(MbLAC),通过生物信息分析发现MaLAC比MbLAC更保守。分子进化树分析结果表明MaLAC可分为5类,MbLAC可分为4类。启动子顺式作用元件分析结果表明,MaLAC启动子序列包含大量光响应、激素应答及非生物胁迫等应激响应元件,推测MaLAC基因家族在响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用。利用qRT-PCR技术对MaLAC部分成员在响应不同低温胁迫的表达情况进行分析,MaLAC3-2、MaLAC4、MaLAC4-5、MaLAC17在低温(13、4、0℃)处理下表达量均极显著高于对照(28℃),推测可能在香蕉响应低温胁迫的过程中发挥重要作用。预测香蕉MaLAC家族有18个成员受miRNA调控,主要受miR397和miR408的调控;推测香蕉MaLAC可能参与miRNA调控途径。

关键词：香蕉漆酶家族成员鉴定生物信息分析低温胁迫

中药火麻仁基原植物大麻的TIFY基因家族鉴定及功能分析

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中国实验方剂学杂志 2020年第24期26卷 134-143页

作者：温东王梦月米要磊马伟孙伟师玉华中国中医科学院中药研究所中药鉴定与安全性评估重点实验室北京100700 黑龙江中医药大学药学院哈尔滨150040

目的:从全基因组层面对大麻(Cannabis sativa)TIFY基因家族进行鉴定与功能分析,为解析大麻TIFY家族基因功能及其对大麻素等次生代谢产物生物合成的调控机理奠定基础。方法:采用已有大麻基因组数据,通过NCBI,PlantTFDB,MEME及TBtools等... 详细信息

目的:从全基因组层面对大麻(Cannabis sativa)TIFY基因家族进行鉴定与功能分析,为解析大麻TIFY家族基因功能及其对大麻素等次生代谢产物生物合成的调控机理奠定基础。方法:采用已有大麻基因组数据,通过NCBI,PlantTFDB,MEME及TBtools等生物信息学分析工具,鉴定大麻中的TIFY家族基因,并对其编码蛋白的理化性质、系统进化、基因结构、染色体定位及组织差异表达模式等进行分析和可视化作图。结果:该研究共鉴定到大麻TIFY家族基因成员14个(CsTIFY1~CsTIFY14),分属于TIFY,JAZ,ZML和PPD共4个亚家族,其核酸序列长度为365~1 369 bp,编码氨基酸长度为118~442 aa,等电点为4.64~9.96。14个CsTIFYs不均匀的分布在8条染色体上,亚细胞定位预测其蛋白均定位细胞核中。CsTIFYs基因的启动子区具有多种非生物胁迫响应的顺式作用元件,可参与植物的不同生长发育和非生物胁迫调控。转录组表达热图分析表明,CsTIFYs在不同大麻品种的雌花及同一品种的花、苞片、茎、叶中均存在表达差异。结论:该研究从全基因组水平鉴定到大麻CsTIFY家族转录因子14个,并对其结构特点和表达模式进行研究,预测大麻CsTIFYs可能在大麻的JA信号转导通路、非生物胁迫及大麻素生物合成中发挥重要调控作用,将对大麻中TIFY家族的基因功能研究以及大麻优质品种选育提供科学参考。

关键词：生物信息学大麻 TIFY基因家族成员鉴定功能分析