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截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

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中国实验血液学杂志 2012年第1期20卷 168-172页

作者：陈伟陈翀张焕新闫志凌程海曾令宇徐开林徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002 南京医科大学江苏南京210029

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c... 详细信息

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。

关键词：成纤维细胞生长因子受体基因慢病毒载体构建基因表达 293FT细胞

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p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

安徽医科大学学报 2024年第3期59卷 398-402页

作者：张春苏丛伍婷朱立雨安徽医科大学附属巢湖医院感染病科巢湖238000 安徽医科大学第一附属医院感染管理科合肥230022 安徽医科大学第一附属医院感染病科合肥230022 安徽省细菌耐药性监控中心合肥230022 安徽医科大学细菌耐药研究所合肥230022

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10... 详细信息

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。

关键词： P62 慢病毒载体构建三质粒包装系统 THP-1细胞肺炎克雷伯菌过表达

禽白血病病毒衣壳蛋白P27慢病毒载体的构建及其在鸡肝癌细胞中的表达

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中国家禽 2021年第3期43卷 16-21页

作者：何倩沈逵秦爱建钱琨扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室江苏扬州225009 扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室江苏扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学比较医学研究院江苏扬州225009

为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G... 详细信息

为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×10^(4)TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。

关键词： ALV P27 慢病毒载体构建蛋白表达

禽白血病病毒衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体的构建及其在鸡肝癌细胞系中的表达

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畜牧与兽医 2021年第4期53卷 89-94页

作者：沈逵何倩秦爱建钱琨扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室江苏扬州225009 扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室江苏扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES... 详细信息

构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×10^(5) TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。

关键词： p15蛋白慢病毒载体构建鸡肝癌细胞系细胞鉴定

Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Naong、Lin28慢病毒构建及兔诱导多能干细胞（riPSCs）的研究

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Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Naong、Lin28慢病毒构建及兔诱导多能...

作者：吕海淼河南农业大学

学位级别：硕士

通过将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等多种转录因子导入成熟体细胞,对其进行重编程而产生的具有多能性的细胞称为诱导多能干细胞（iPSCs）。iPSCs可以分化为体内所有细胞类型,并在医学、农业和生物技术方面有着巨大的应用潜力。然而,重编程... 详细信息

通过将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等多种转录因子导入成熟体细胞,对其进行重编程而产生的具有多能性的细胞称为诱导多能干细胞（iPSCs）。iPSCs可以分化为体内所有细胞类型,并在医学、农业和生物技术方面有着巨大的应用潜力。然而,重编程背后的分子机制在很大程度上仍然处于未知状态,并阻碍了真正的iPSCs的产生及其在临床实践中的应用。本研究通过对兔胎儿成纤维细胞的分离培养、特异性转录因子的克隆及慢病毒载体构建、将兔胎儿成纤维细胞诱导为iPSCs等试验研究,对建立更加完善兔iPSCs诱导体系和更高效的兔体细胞重编程为iPSCs的方法进行探究,为iPSCs在畜牧业及生命科学的应用提供参考。（1）兔成纤维细胞的分离培养与饲养层的制备采用胰酶消化法在体外成功分离了 14～16d胎龄的兔胎儿成纤维细胞,将分离的细胞接种于培养瓶后,3～4h后REF贴壁生长,2d细胞达80%～90%融合度,传代2～3次后可将上皮细胞及其他杂细胞除去得到纯度较高的REF。获得的REF形态典型,为长梭形,生长曲线接近“S”型。选P3-P5代纯度高、活力好的REF制作饲养层,REF经丝裂霉素C处理2.5小时后,细胞形态变化不明显,有较好的细胞活力,可用于后续iPSCs的培养。试验成功分离培养出形态典型、纯度高、生长状态好的REF,通过观察其生长特性,总结其体外培养规律,为iPSCs的研究提供充足、可靠的种子细胞。（2）iPSCs相关特异性转录因子的克隆及慢病毒载体构建根据NCBI中公布的兔Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Naong和Lin28序列信息为模板,设计合成扩增兔特异性转录因子的引物。分别以14～16d胎龄的兔胎儿脑组织、躯干组织、原始生殖嵴为材料,采用RT-PCR方法克隆出兔的六个特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Naong、Lin28基因完整的开放阅读框序列（CDS）。将克隆得到的各基因连接到慢病毒真核表达载体上,并测序鉴定。经测序结果与参考模板序列比对分析,所克隆的特异性转录因子匹配度均达到100%,表明特异性转录因子成功克隆。且测序结果证实,六个特异性转录因子的CDS正确插入到真核表达载体中,成功构建了慢病毒Fuw-teto-rOct4、Fuw-teto-rSox2、Fuw-teto-rKlf4、Fuw-teto-rc-Myc、Fuw-teto-rNaong、Fuw-teto-rLin28,为下一步制备riPSCs奠定分子基础。（3）慢病毒的包装及感染兔胎儿成纤维细胞的研究对构建的携带rOct4、rSox2、rKlf4、rc-Myc、rNaong、和rLin28六个特异性转录因子的慢病毒载体和购买的携带hOct4、hSox2、hKlf4、hc-Myc四个人源特异性转录因子的慢病毒载体进行包装,并对体外分离培养的兔胎儿成纤维细胞进行感染,诱导兔胎儿成纤维细胞重编程形成riPSCs。进而对比两套慢病毒载体的诱导效率,以及永生化质粒PCI-neo-hTERT是否促进了 riPSCs形成效率。筛选一套完善的riPSCs诱导培养体系,建立了提高riPSCs的生产效率的方法,为后续riPSCs研究奠定基础。研究结果发现,两种不同来源的慢病毒系统所包装出慢病毒能够有效地侵染兔胎儿成纤维细胞,并形成iPSCs克隆。且兔源的六个特异性转录因子形成克隆效率高于人源的四个特异性转录因子形成克隆效率。而PCI-neo-hTERT的加入并没有促进兔iPSCs克隆的出现。

关键词：成纤维细胞分离培养特异性转录因子慢病毒载体构建诱导性多能干细胞兔