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半夏泻心汤对过表达IL-12基因BMSCs靶向治疗胃癌的增效作用研究

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半夏泻心汤对过表达IL-12基因BMSCs靶向治疗胃癌的增效作用研究

作者：吕洋超甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的构建慢病毒介导过表达IL-12基因的BMSCS,观察IL-12基因转染的BMSCs对胃癌移植瘤模型裸鼠的抑瘤作用,探讨半夏泻心汤与IL-12基因转染BMSCs联合对胃癌移植瘤模型裸鼠的抑瘤作用是否有协同增效作用。方法1、无菌条件下取裸鼠股骨,充分... 详细信息

目的构建慢病毒介导过表达IL-12基因的BMSCS,观察IL-12基因转染的BMSCs对胃癌移植瘤模型裸鼠的抑瘤作用,探讨半夏泻心汤与IL-12基因转染BMSCs联合对胃癌移植瘤模型裸鼠的抑瘤作用是否有协同增效作用。方法1、无菌条件下取裸鼠股骨,充分冲洗骨髓腔,加入适量含10%胎牛血清的低糖DMEM,离心5～10 min弃上清,加完全培养基培养。当细胞汇合达90%以上时0.25%胰酶-EDTA消化传代。取融合良好的P3代BMSCs,消化、离心,弃上层液体,加入一抗、二抗,孵育,重悬细胞后上FCM检测。2、采用LV5空载慢病毒及IL-12过表达LV5慢病毒转染BMSCs细胞,48h及72小时后,用倒置荧光显微镜观察BMSCs细胞转染的情况,计算慢病毒转染BMSCs的效率。经嘌呤霉素加压筛选,并用荧光定量PCR检测BMSCs细胞中IL-12的表达,建立稳定过表达IL-12基因的BMSCs细胞。3、取SPF级健康BALB/C裸鼠,于裸鼠腋窝皮下接种人胃癌BCG-823细胞,建立人胃癌移植瘤裸鼠模型。4、将人胃癌移植瘤裸鼠随机分为成瘤组(模型组)、LV5空载慢病毒转染BMSCs组(空载组)、LV5-IL-12过表达慢病毒转染BMSCs组(转染组)、半夏泻心汤干预组(药物组)、半夏泻心汤联合LV5-IL-12过表达慢病毒转染BMSCs组(联合组)。模型组给予裸鼠生理盐水灌胃,空载组将空载慢病毒转染的BMSCs给予裸鼠尾静脉注射,转染组将IL-12基因过表达慢病毒转染BMSCs给予裸鼠尾静脉注射,药物组将半夏泻心汤灌胃给药,联合组在尾静脉注IL-12过表达慢病毒转染BMSCs的同时,给予半夏泻心汤灌胃给药,连续干预13d。5、各组经干预后,观察裸鼠一般情况,隔日计算各组胃癌移植瘤裸鼠肿瘤体积、体重及生长情况的变化,计算抑瘤率。6、将各组胃癌移植瘤瘤体组织进行包埋、切片、贴片处理,通过免疫荧光染色,采用激光共聚焦显微镜下观察BMSCs在肿瘤组织的分布,进行细胞计数,计算BMSCs在肿瘤组织的分布。7、将各组胃癌移植瘤瘤体组织进行包埋、切片,制备TUNEL反应混合液,添加细胞核染色液,苏木素染色,封固,光镜下观察肿瘤细胞凋亡情况,并计算凋亡指数(AI)。8、将各组胃癌移植瘤瘤体组织进行包埋、切片,加入一抗、二抗,孵育,中性树胶封片。采用免疫组织化学法检测瘤体组织Bax、Bcl-2蛋白表达,并进行平均光密度值测定分析。结果1、BMSCs培养7天后细胞以达70%-80%融合,细胞为典型的长梭形,并呈集落生长。传代以后,细胞增殖活力强,细胞形态比较均一的长梭形、多角形细胞,其他形态的细胞极少见,达到传代标准。第3代BMSCs的CD44阳性表达为96.68%,而CD34阳性表达极低,仅为1.25%。2、BMSCs细胞转染48h以后,普通光镜下细胞形态规则,生长良好,荧光显微镜下空载慢病毒转染的BMSCs及IL-12基因过表达转染的BMSCs绿色荧光强度增强。72h以后细胞融合现象明显,绿色荧光强度达到最高,转染效率可达90%。3、Q-PCR结果表明,经慢病毒转染后IL-12 m RNA稳定表达于BMSCs中,IL-12m RNA的表达较正常BMSCs、空载慢病毒转染BMSCs组明显升高,差异有统计学意义(P慢病毒转染BMSCs组IL-12 m RNA的表达无显著差异(P>0.05)。4、裸鼠成瘤显示,第3d后裸鼠腋下逐渐出现肿块,并逐渐增大,5～7d肿块无明显变化,第9d后肿块明显增加,第13d各组裸鼠瘤块均显著增加。与模型组及空载组比较,转染组、药物组及联合组瘤块增加较小,有显著统计学意义(P转染组、药物组比较,联合组瘤块增加最小,有显著统计学意义(P转染组、药物组及联合组的抑瘤率分别为36.9%、42.3%、60.5%,差异有统计学意义(P转染组及联合组的肿瘤组织中均可观察到蓝色荧光,分布比较密集。与空载组比较,转染组及联合组肿瘤组织BMSCs的分布明显增多,差异有显著统计学意义(P转染组比较,联合组显著增多,差异有显著统计学意义(P转染组、药物组及联合组胃癌荷瘤裸鼠瘤体组织中出现大量细胞凋亡小体(褐色颗粒),模型组及空载组仅出现少量细胞凋亡小体。与模型组及空载组比较,转染组、药物组及联合组凋亡指数均明显增加,差异有统计学意义(P>0.05)。与转染组及药物组比较,联合组细胞凋亡小体明显增多,凋亡指数明显增加,差异有统计学意义(P转染组

关键词：半夏泻心汤骨髓间充质干细胞慢病毒转染胃癌

shRNA干扰小鼠大肠癌CT26细胞PARG对癌细胞与血小板粘附的影响及可能的机制

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shRNA干扰小鼠大肠癌CT26细胞PARG对癌细胞与血小板粘附的影响及...

作者：颜佳欣重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨shRNA干扰小鼠大肠癌CT26细胞PARG表达后,对癌细胞与血小板粘附的影响及其相关机制。方法:采用搭载PARG-shRNA干扰片段的慢病毒（lentivirus）载体转染小鼠大肠癌细胞CT26株,对PARG实施沉默干扰。以未作处理的CT26细胞作... 详细信息

目的:探讨shRNA干扰小鼠大肠癌CT26细胞PARG表达后,对癌细胞与血小板粘附的影响及其相关机制。方法:采用搭载PARG-shRNA干扰片段的慢病毒（lentivirus）载体转染小鼠大肠癌细胞CT26株,对PARG实施沉默干扰。以未作处理的CT26细胞作为阴性对照组（blank control group）,转染慢病毒空载体的CT26细胞作为空载体对照组（transfected with empty viral particles control group）,转染PARG-shRNAi慢病毒载体的CT26细胞作为PARG沉默组（PARG-shRNAi group）,Real time PCR法检测转染PARG-shRNA后CT26细胞PARG mRNA的表达,以测定沉默效果。采用活细胞染色法,在形态学上观察CT26细胞和血小板的粘附。Western blot法检测CT26细胞中PARG、PARP、Pi-akt、NF-κB、P-selectin和ICAM-1的表达,为证实PARG是通过Pi-akt信号通路调节下游因子,用akt磷酸化特异性抑制剂LY294002处理PARG沉默组CT26细胞,作为磷酸化akt抑制组（Pi-akt restrain group）。结果: 1.在real time PCR与western blot实验中,与对照组相比,PARG沉默组CT26细胞PARG表达量均明显降低（P＜0.05）,而阴性对照组PARG表达与空载体对照组相比则无明显变化（P＞0.05） 2.在粘附实验中,与阴性对照组相比,空载体对照组CT26细胞与血小板的粘附率无明显变化（P＞0.05）。与阴性对照组相比,PARG沉默组CT26细胞与血小板的粘附率明显降低（P＜0.05）。与PARG沉默组相比,磷酸化akt抑制组CT26细胞与血小板粘附率有明显上升（P＜0.05）。 3.在WB实验中,与阴性对照组相比,空载体对照组CT26细胞PARG、PARP、Pi-akt、NF-κB、ICAM-1、P-selectin表达均无明显变化（P＞0.05）。与阴性对照组相比,PARG沉默组CT26细胞PARG、PARP、NF-κB、ICAM-1、P-selectin明显降低（P＜0.05）,Pi-akt明显升高（P＜0.05）。与PARG沉默组细胞相比较,磷酸化akt特异性抑制剂处理后的CT26细胞Pi-akt蛋白表达明显下降（P＜0.05）,而NF-κB、ICAM-1、P-selectin明显上升（P＜0.05）。结论: 1. PARG—shRNA慢病毒转染小鼠大肠癌CT26细胞后,成功沉默CT26细胞PARG的表达,且慢病毒载体本身对CT26细胞内各蛋白表达、生物学行为没有影响。 2、抑制PARG可明显抑制小鼠大肠癌CT26细胞与血小板的粘附能力。提示:PARG可能在癌栓形成过程中有重要作用。 3. PARG抑制的CT26细胞,其PARG、PARP、NF-κB、ICAM-1、P-selectin下降,Pi-akt表达增高,提示:PARG抑制降低CT26细胞与血小板之间的粘附,可能是通过下调PARP,上调Pi-akt信号通路,抑制NF-κB,进而降低ICAM-1、P-selectin的表达而实现。

关键词： PARG 慢病毒转染细胞粘附 Pi-akt 大肠癌

外源基因CXCR4转染对山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学特性影响的实验研究

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外源基因CXCR4转染对山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学特性影响...

作者：高乾坤南昌大学

学位级别：硕士

目的:本实验研究比较不同的方法对获取组织修复所需的种子细胞的影响,探讨慢病毒载体携带外源基因转染BMSCs后对细胞的生物学特性的影响方法:用密度梯度离心法和全骨髓培养法分离提纯山羊骨髓间充质干细胞;用流式细胞仪鉴定BMSCs的表面... 详细信息

目的:本实验研究比较不同的方法对获取组织修复所需的种子细胞的影响,探讨慢病毒载体携带外源基因转染BMSCs后对细胞的生物学特性的影响方法:用密度梯度离心法和全骨髓培养法分离提纯山羊骨髓间充质干细胞;用流式细胞仪鉴定BMSCs的表面抗原标志物CD29、CD60L、CD44、CD45;用茜素红染色、油红“O”染色、甲苯胺蓝染色分别检测外源基因CXCR4转染前后BMSCs成骨、成脂、成软骨分化的潜能;用细胞增殖实验及流式细胞仪检测外源基因转染后细胞生长情况的变化等结果:两种方法均成功的提取出了BMSCs;细胞表面标志物通过鉴定发现CD29、CD44属于高表达,而CD60L,CD45低表达;外源基因成功转染BMSCs之后实现了目的基因的高表达,细胞多向分化潜能仍然存在,BMSCs活性及周期未发生明显改变。结论:我们研究结果表明外源基因转染BMSCs在体外诱导下仍然具有多向分化的潜能,外源基因转染BMSCs后稳定高表达,在SDF-1趋化作用下可以实现细胞的迁移、归巢的目的。

关键词：山羊间充质干细胞 CXCR4基因慢病毒转染

miR-21诱导犬BMSCs骨向分化的体外实验研究

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miR-21诱导犬BMSCs骨向分化的体外实验研究

作者：王颖安徽医科大学

学位级别：硕士

目的通过慢病毒载体基因转染技术,体外研究miR-21诱导拉布拉多犬的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)成骨向分化的作用,并应用多种方法进行检测,为将来的体内骨缺损修复提供实验数据支持。方法使用全骨髓贴壁... 详细信息

目的通过慢病毒载体基因转染技术,体外研究miR-21诱导拉布拉多犬的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)成骨向分化的作用,并应用多种方法进行检测,为将来的体内骨缺损修复提供实验数据支持。方法使用全骨髓贴壁培养法在体外培养拉布拉多犬BMSCs;构建慢病毒载体Lenti-miR-21-Luciferase与Lenti-Lac Z-Luciferase,分别转染犬BMSCs,将研究分为miR-21实验组与Lac Z对照组;转染后4 d,倒置显微镜下观察细胞,通过生物发光成像法观察转染后两组细胞的示踪报告基因Luciferase的荧光发光强度检测慢病毒转染效率;MTT比色法检测慢病毒转染后BMSCs的增殖情况;利用细胞划痕实验比较转染后BMSCs的迁移能力;慢病毒转染后的第14天,通过茜素红S染色与碱性磷酸酶(ALP)染色观察BMSCs的体外骨形成情况;在转染后的第0、1、4、7、14 d,分别提取miR-21实验组与Lac Z对照组BMSCs的m RNAs和蛋白;通过Real time-PCR技术和Western blot检测成骨关键因子骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果显微镜下观察BMSCs形态较为均一,多呈纺锤形或长梭形,细胞排列呈旋涡状或放射状融合,生长状态良好;MOI值为10时,BMSCs的转染效率最高,Luciferase的荧光发光强度检测结果表明示踪基因Luciferase在BMSCs中连接成功;miR-21实验组划痕宽度减少平均值为372.33μm,而Lac Z对照组仅为161.33μm,P﹤0.001(F=0.10),差异具有统计学意义,提示miR-21实验组的BMSCs细胞爬行迁移能力显著增强;钙结节染色与ALP染色结果提示,相较于Lac Z对照组,miR-21实验组中钙结节与ALP的表达均显著提高;Real time-PCR定量结果显示,miR-21实验组的BMSCs在慢病毒转染后7 d即有OCN基因和OPN基因的显著高表达,而在转染后的14 d,两基因仍维持较高表达水平,结果提示miR-21能够显著增强BMSCs中关键成骨相关因子的表达(P﹤0.05);Western blot检测结果显示,miR-21可以显著上调BMSCs成骨分化中OCN和OPN的蛋白表达(P﹤0.05),且表达趋势与m RNA的表达趋势相近。结论以慢病毒作为载体的miR-21能够成功转染BMSCs,并在细胞中能够持续高效的增强成骨相关因子的表达。miR-21可以显著促进BMSCs的骨向分化,为进一步体的内实验奠定基础。

关键词： miR-21 骨髓间充质干细胞慢病毒转染骨向分化

褪黑激素通过Wnt10b调控绒毛周期生长机制的研究

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褪黑激素通过Wnt10b调控绒毛周期生长机制的研究

作者：宫文典内蒙古农业大学

学位级别：硕士

内蒙古绒山羊是我国优质种质资源,具有绒肉兼备的优良特性,因其羊绒具有纤细洁白和柔软的特点,享有“软黄金”的称号。绒毛是由毛囊发育而来,毛囊的启动和生长是由20多种细胞共同调控,毛乳头细胞是毛囊的“信号中心”,也是多种激素和小... 详细信息

内蒙古绒山羊是我国优质种质资源,具有绒肉兼备的优良特性,因其羊绒具有纤细洁白和柔软的特点,享有“软黄金”的称号。绒毛是由毛囊发育而来,毛囊的启动和生长是由20多种细胞共同调控,毛乳头细胞是毛囊的“信号中心”,也是多种激素和小分子物质的靶标,可以间接通过调控激素来影响毛囊周期的生长。褪黑素是一种具有昼夜节律的吲哚类激素,已有许多研究证明褪黑素可促进次级毛囊的发生发育从而调控羊绒生长周期。Wnt10b是Wnt通路中的重要因子,可以调控毛囊的启动和发育。为进一步探究褪黑素通过Wnt10b调控毛囊周期生长的作用机制,通过培养内蒙古绒山羊毛乳头细胞、建立褪黑素细胞系、Wnt10b干扰细胞系、Wnt10b过表达细胞系,采用qRT-PCR、Western blot技术检测Wnt10b调控毛囊发育相关基因β-catenin、Lef1、FGF21、APC2、SFRP1的表达,从而阐明褪黑激素调控绒毛周期生长的作用机制,研究结果如下:1.采用CCK-8法在内蒙古绒山羊毛乳头细胞中添加不同浓度的褪黑素,分别为0pg/m L(对照组)、100pg/m L、300pg/m L、600pg/m L、900pg/m L,根据生长曲线和细胞生长活力数值确定褪黑素促进内蒙古绒山羊毛乳头细胞增殖的最适浓度为300pg/m L。2.包装构建Wnt10b过表达载体,并将Wnt10b干扰和过表达慢病毒转染至毛乳头细胞与褪黑素处理细胞中,GFP荧光显示转染效率达80%以上,通过qRT-PCR与Western blot技术检测Wnt10b表达量,与对照组相比干扰组表达量极显著降低、过表达组极显著升高,说明干扰、过表达构建成功(P0.05)且褪黑素+过表达Wnt10b组较褪黑素组和过表达Wnt10b组极显著增加(P<0.01)。APC2和SFRP1各组的表达量与对照组相比均呈现极显著下调(P<0.01)。*** Blot技术检测结果显示:褪黑素组和过表达Wnt10b组与对照组相比极显著提高β-catenin蛋白表达量(P<0.01),极显著降低SFRP1蛋白表达量(P<0.01)。与对照组相比干扰Wnt10b极显著降低β-catenin、SFRP1蛋白表达量(P<0.01)。综上所述,褪黑素可能通过Wnt10b调控与毛囊发育相关基因的表达从而对毛囊的生长发育起到促进作用。

关键词：内蒙古绒山羊 Wnt10b 毛乳头细胞褪黑素慢病毒转染

转染HGF的人脐带间充质干细胞对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响

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转染HGF的人脐带间充质干细胞对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通...

作者：汪文颖吉林大学

学位级别：硕士

目的:本文旨在通过将携带HGF基因的h UCMSCs移植到肝纤维化大鼠体内的实验,探讨其抑制肝纤维化的可能作用机制,为抗肝纤维化的治疗带来新的策略。方法:在体外实验中,首先,通过组织块贴壁法获得h UCMSCs,将其分为3组,对照组:常规培养的h ... 详细信息

目的:本文旨在通过将携带HGF基因的h UCMSCs移植到肝纤维化大鼠体内的实验,探讨其抑制肝纤维化的可能作用机制,为抗肝纤维化的治疗带来新的策略。方法:在体外实验中,首先,通过组织块贴壁法获得h UCMSCs,将其分为3组,对照组:常规培养的h UCMSCs,HGF组:转染HGF慢病毒的h UCMSCs,LV5-NC组:转染慢病毒空载体的h UCMSCs。于转染不同时间后观察各组细胞形态,MTT法检测各组细胞的生长曲线,采用ELLSA和Western Bolt检测各组细胞HGF蛋白的表达。其次,通过A-P-A法制备上述三组细胞的微囊及不含细胞的空微囊。在体内实验中,采用CCl4腹腔注射联合高脂低蛋白饮食法建立大鼠肝纤维化模型。8w后通过观察正常对照组和CCl4模型组大鼠生活状态、检测血清生化指标ALT、AST、ALP、GGT和ALB的含量变化,检测大鼠肝脏病理学变化验证模型是否成功。CCl4模型成功后的大鼠随机分为h UCMSCs组、HGF组、LV5-NC组和空微囊组,通过腹腔移植各组微囊,2w后通过HE和Masson染色检测各组大鼠肝脏病理学变化;运用免疫组织化学和Western Bolt检测各组大鼠肝脏中CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β1、α-SMA、Smad2和Smad3蛋白的表达;采用RT-PCR检测各组大鼠肝脏中CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β1、α-SMA、Smad2和Smad3 m RNA的表达。结果:1、体外实验中,HGF组和LV5-NC组的h UCMSCs在形态、增殖能力与对照组相比,没有明显差异;而HGF组的h UCMSCs表达HGF蛋白的含量显著高于LV5-NC组和对照组(P0.05)。2、经CCl4腹腔注射联合高脂低蛋白饮食法造模8w,CCl4组与正常对照组相比,ALT、AST、ALP、GGT水平均明显上升(P0.05)。结论:1、携带HGF基因的h UCMSCs能够减少胶原的产生、抑制α-SMA的表达,从而抑制肝纤维化进程。2、转染HGF的h UCMSCs能够降低TGF-β1、Smad2和Smad3的表达,其阻止肝纤维化的作用机制与其抑制TGF-β1/Smads信号通路密切相关。

关键词：人脐带间充质干细胞肝纤维化 A-P-A微囊 HGF 慢病毒转染 TGF-β1/Smads

急性T淋巴细胞白血病中EZH2介导的细胞增殖和EZH2抑制剂抗白血病机制研究

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急性T淋巴细胞白血病中EZH2介导的细胞增殖和EZH2抑制剂抗白血病...

作者：高雨乔东南大学

学位级别：硕士

目的:Zest基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)具有组蛋白甲基转移酶活性,可调控染色质构象、沉默相关靶基因转录,在生理和病理过程中有着重要、广泛而多方面的作用。在包括急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic le... 详细信息

目的:Zest基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)具有组蛋白甲基转移酶活性,可调控染色质构象、沉默相关靶基因转录,在生理和病理过程中有着重要、广泛而多方面的作用。在包括急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)在内的多种血液系统肿瘤及多种实体瘤中,EZH2表达水平增高是疾病发生发展、侵袭性高和预后差的相关因素。EZH2抑制剂已在淋巴瘤等多种恶性肿瘤细胞中被初步证实了其抗肿瘤作用。并且,在ALL患者中还发现存在EZH2基因突变,这可能导致其功能紊乱,在ALL的发生发展中有重要作用。在本研究中,我们将探讨EZH2突变对急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)中EZH2表达和细胞增殖等的影响;以及探讨EZH2抑制剂GSK126对T-ALL细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期等的功能机制。方法:利用点突变试剂盒构建EZH2病毒质粒载体,在T-ALL细胞CEM中建立慢病毒稳定转染EZH2的突变型细胞、EZH2的野生型细胞和空载体的EZH2对照细胞。采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测EZH2、EZH2和EZH2CEM细胞的OD(optical density,光密度)值,以及EZH2抑制剂GSK126对CEM细胞增殖水平的影响,采用Annexin PE/7-AAD双染法测定GSK126对细胞凋亡的影响,采用PI(propidium iodide,碘化丙啶)单染法测定GSK126对细胞周期的影响。采用荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)分别检测EZH2,EZH2和EZH2CEM细胞中EZH2转录水平和蛋白水平表达差异;以及GSK126对肿瘤相关基因[EZH2、PTEN(phosphatase and tensin homolog,磷酸酶-张力蛋白基因)]、细胞凋亡相关基因[Bcl-2(B-cell lymphoma-2,B淋巴细胞瘤-2)、Bcl-xl(Bcl2-like 1,Bcl2样蛋白1)]和细胞周期相关基因[p15(cyclin dependent kinase inhibitor 2B,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B)、p16(cyclin dependent kinase inhibitor 2A,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A)]转录和蛋白相对表达水平的影响。结果:成功构建稳定转染EZH2的CEM细胞。EZH2、EZH2和EZH2CEM细胞在各时间点的OD值均随着培养时间延长而增加。各时间点EZH2的OD值均大于EZH2,在培养3天后两者OD值差异有统计学意义(P<0.01);此外,EZH2在各时间点的OD值也要高于EZH2,两者OD值差异在培养3天后有统计学意义(P<0.01)。EZH2的EZH2mRNA和EZH2蛋白相对表达量高于EZH2,两者EZH2mRNA相对表达量差异有统计学意义(P<0.001)。EZH2抑制剂GSK126可降低CEM的细胞增殖水平。GSK126处理CEM细胞24小时的IC50(50%inhibitory concentration,50%抑制浓度)值为14.10μM。我们还观察了GSK126抗白血病作用可能存在的分子机制。GSK126可降低CEM细胞EZH2mRNA和蛋白的表达量。同时,GSK126可上调PTENmRNA和蛋白水平,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达,诱导CEM细胞凋亡;GSK126可上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p15和p16mRNA和蛋白的表达,将CEM细胞阻滞于G1期(DNA合成前期)。结论:T-ALL细胞CEM在EZH2发生K466T突变后,细胞增殖能力增强,EZH2mRNA和蛋白表达水平上升。这表明EZH2是一个功能获得性突变。EZH2抑制剂GSK126可抑制T-ALL细胞CEM增殖,并通过调节EZH2表达、影响抑癌基因PTEN通路、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达,诱导细胞凋亡,以及通过上调p15和p16引起细胞周期停滞。这些结果表明EZH2抑制剂具有抑制细胞增殖和凋亡作用,提示其可能在控制T-ALL发生和发展中发挥重要作用,有望为T-ALL临床治疗提供新靶标。

关键词： EZH2 基因突变 GSK126 慢病毒转染急性淋巴细胞白血病细胞增殖细胞凋亡细胞周期

大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应

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江苏医药 2012年第7期38卷 745-748页

作者：张红曼李剑波晏玲飞解敏徐宽枫许馨予陈恒杨涛陈家伟南京医科大学第一附属医院内分泌病科江苏省210029

目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和... 详细信息

目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组)。RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况。结果与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P慢病毒表达载体。其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加。

关键词： Neuritin基因 shRNA载体慢病毒转染雪旺细胞凋亡

RNA干扰SATB1基因对乳腺癌干细胞Wnt信号通路的影响

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RNA干扰SATB1基因对乳腺癌干细胞Wnt信号通路的影响

作者：谢辉南昌大学

学位级别：硕士

背景：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，复发和转移是导致乳腺癌治疗失败的主要原因。研究显示肿瘤中存在着少量肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC），CSC是肿瘤发生、转移和复发的根源之一。CSC受一系列信号转导通路的调控，Wnt/β-c... 详细信息

背景：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，复发和转移是导致乳腺癌治疗失败的主要原因。研究显示肿瘤中存在着少量肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC），CSC是肿瘤发生、转移和复发的根源之一。CSC受一系列信号转导通路的调控，Wnt/β-catenin通路是其中的一种。SATB1（special AT rich sequence bindingprotein，SATB1）是一种组织特异性表达的核基质结合蛋白，SATB1通过调控Wnt/β-catenin通路影响肿瘤发生、浸润、转移及复发。目的：采用RNAi抑制乳腺癌干细胞SATB1表达，观察乳腺癌干细胞wnt-1、β-catenin的变化，研究SATB1对乳腺癌干细胞Wnt/β-catenin通路研究的影响。方法： 1根据GenBank提供的SATB1基因序列，利用siRNA的合成原则，合成4组含干扰SATB1序列并包装至慢病毒载体。 2为对照需要及摸索感染条件，将不含干扰序列的空包病毒转染MCF-7细胞得MCF-7/siControl作为阴性对照。 34组慢病毒载体分别转染MCF-7细胞，然后采用实时荧光定量PCR和Western blot，检测4组MCF-7细胞SATB1mRNA和蛋白，筛选出SATB1基因抑制效果最好的MCF-7细胞(MCF-7/siSATB1)。 4根据乳腺癌干细胞的特异性免疫标记CD44+CD24-，通过流式细胞术分选出MCF-7干细胞、MCF-7/siControl干细胞和MCF-7/siSATB1干细胞。 5实时荧光定量PCR检测上述三组乳腺癌干细胞wnt-1、β-catenin mRNA表达。结果： 1成功构建4组人SATB1基因干扰的重组慢病毒：SATB1/GV115-RNAi#1、SATB1/GV115-RNAi#2、SATB1/GV115-RNAi#3、SATB1/GV115-RNAi#4，经包装产生的病毒滴度均大于1.0×108TU/ml。 2空包病毒载体及上述4组SATB1基因干扰的重组慢病毒分别转染MCF-7细胞，2-3天后GFP荧光表达均＞70%，证实重组慢病毒转染MCF-7成功。MOI=20，添加完全ENi.S组的转染效率最高为94.85%。 34种重组慢病毒感染的MCF-7细胞中，SATB1/GV115-RNAi#4组MCF-7细胞的SATB1mRNA相对表达量0.397±0.12，SATB1蛋白标化后的净光密度值为0.5332±0.027，与阴性对照组和空白对照组比较，经SPSS17.0两个独立样本的t检验计算，差异具有统计学意义（P＜0.05）。SATB1/GV115-RNAi#4组MCF-7细胞的SATB1mRNA抑制率为60.3%，蛋白抑制率46.68%，符合RNA干扰要求（大于30%），将SATB1/GV115-RNAi#4MCF-7细胞作为MCF-7/siSATB1。 4流式细胞仪检测MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1细胞标记CD44+CD24-的表达。结果：①MCF-7：3.05%;②MCF-7/siControl：2.62%;③MC F-7/siSATB1：0.79%。然后采用流式细胞分选术成功分选MCF-7、MCF-7/siControl和MCF-7/siSATB1干细胞，并提取mRNA。 5实时荧光定量PCR检测MCF-7干细胞、 MCF-7/siControl干细胞和MCF-7/siSATB1干细胞的SATB1、 wnt-1、 β-catenin的表达，结果：①MCF-7/siSATB1干细胞SATB1基因mRNA相对表达量为0.164±0.17，与阴性对照组和空白对照组比较，经SPSS17.0两个独立样本的t检验计算，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MCF-7/siSATB1干细胞SATB1抑制率86.3%。②MCF-7/siSATB1干细胞wnt-1基因mRNA相对表达量为0.367±0.17，与阴性对照组和空白对照组比较，经SPSS17.0两个独立样本的t检验计算，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MCF-7/siSATB1干细胞wnt-1抑制率63.3%。③MCF-7/siSATB1干细胞β-catenin基因mRNA相对表达量为0.307±0.17，与阴性对照组和空白对照组比较，经SPSS17.0两个独立样本的t检验计算，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MCF-7/siSATB1干细胞β-catenin抑制率69.3%。结果显示MCF-7/siSATB1组干细胞的SATB1、wnt-1、β-catenin的mRNA表达降低。结论： RNAi抑制乳腺癌干细胞SATB1表达，可以影响乳腺癌干细胞Wnt通路中wnt-1、β-catenin的

关键词：慢病毒转染 RNA干扰 SATB1基因 Wnt/β-catenin信号通路实时荧光定量PCR Western blot 流式细胞术