检索结果-南通市图书馆

慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

天津医药 2013年第12期41卷 1137-1141,I0001页

作者：王力张宁坤徐小红郑楠高连如朱智明第二军医大学海军临床医学院北京100048 中国人民解放军海军总医院心脏中心

目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数(MOI)值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采... 详细信息

目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数(MOI)值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接,转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞,根据转染效率得到最佳MOI值,并采用Real-timePCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284 bp的目的基因片段,与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒,测序结果与预期完全符合,并成功包装慢病毒颗粒。最佳MOI值为20,转染效率为(90.32±3.61)%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAGpSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞,并可持续高表达apelin基因。

关键词：间质干细胞慢病毒属遗传载体转染基因表达 apelin

p38MAPK基因RNAi慢病毒载体的构建及在MC3T3-E1细胞的表达

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

第三军医大学学报 2010年第15期32卷 1598-1601页

作者：冯正平邓华聪姜蓉杜佳陈丹燕梁小燕重庆医科大学:附属第一医院内分泌科重庆400016 重庆医科大学干细胞与组织工程实验室重庆400016

目的构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响。方法设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定... 详细信息

目的构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响。方法设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒,流式细胞仪检测病毒滴度,p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染体外培养MC3T3-E1细胞,荧光定量PCR检测MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达,进行p38MAPK干扰有效靶点的筛选。22.2 mol/L葡萄糖刺激培养MC3T3-E1细胞7 d,Westernblot检测MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白的表达,流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡。结果酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确,所得质粒分别命名为p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3,流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×108、2.8×108、2.5×108TU/ml。p38MAPK-shRNA转染MC3T3-E1细胞效率达到74%以上,RT-PCR检测结果显示,各p38MAPK-shRNA转染组MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达较正常对照组分别下降了78.8%、84.3%和60.2%(P慢病毒转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达水平较高糖组明显下调(P慢病毒转染组以及p38MAPK信号转导阻断剂组较高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率明显减少(P慢病毒载体,其能有效抑制MC3T3-E1细胞p38MAPK基因表达,减少高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。

关键词： p38MAPK 成骨细胞 RNA干扰慢病毒属

粒-巨噬细胞集落刺激因子与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体构建

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国病理生理杂志 2005年第7期21卷 1448-1451页

作者：李先茂沈丽佳朱梅刚李祖国赵彤南方医科大学病理学教研室广州中医药大学第一临床医院肿瘤科暨南大学医学院广东广州510632

目的:构建粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:采用RT-PCR方法获得GM-CSF全外显子片段,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。在脂质体介导下... 详细信息

目的:构建粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:采用RT-PCR方法获得GM-CSF全外显子片段,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-GM-CSF导入病毒包装细胞293T,荧光显微镜检测基因的表达,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩,鉴定。用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测转染FUGW-GM-CSF细胞上清液GM-CSF表达水平,电子显微镜观察293T细胞中的慢病毒。结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的GM-CSF/PCR产物与GenBank中的数据完全吻合;GM-CSF准确克隆入FUGW的多克隆位点。慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞,荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。转染FUGW-GM-CSF包装细胞上清液GM-CSF酶联反应阳性。电子显微镜下见慢病毒颗粒位于293T细胞胞浆的内质网中。结论:成功构建了GM-CSF与GFP融合基因慢病毒载体,为诱导DC提供了适合的稳定转染的载体。

关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子绿色荧光蛋白慢病毒属

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中华检验医学杂志 2008年第8期31卷 919-923页

作者：王峰陈琳邵建国毛振彪南通大学附属医院检验科 226001 南通大学附属医院消化内科 226001 南通大学附属南通第三人民医院检验科南通大学附属南通第三人民医院消化内科

目的构建针对人的增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand，APRIL）基因的短发夹RNA（small hairpin RNA，shRNA）慢病毒表达载体，并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数（multiplicity of infection，MOI）值。方... 详细信息

目的构建针对人的增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand，APRIL）基因的短发夹RNA（small hairpin RNA，shRNA）慢病毒表达载体，并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数（multiplicity of infection，MOI）值。方法以人APRIL基因为靶点，筛选出3条shRNA靶序列：shAPRILl210、shAPRILl754、shAPRILl604；各自合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGCL-GFP载体连接，构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRILl210、LV-shAPRILl754、LV-shAPRILl604；将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞，经PCR及DNA测序鉴定。再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共转染293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值。结果PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRILl210、LV-shAPRILl754、LV-shAPRILl604的预期结果一致，经包装产生的慢病毒滴度分别为5×10^7、6×10^7、4×10^7转导单位（TU）／ml；适合高效感染的MOI值为5。结论成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL，为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础。

关键词：慢病毒属膜蛋白质类肿瘤坏死因子类 RNA 小分子干扰遗传载体

慢病毒介导的RNA干扰对大鼠神经元PKCγ mRNA及蛋白表达的影响

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中华麻醉学杂志 2010年第4期30卷 430-432页

作者：邹望远郭曲练宋宗斌刘畅潘韫丹中南大学湘雅医院麻醉科长沙市410008

目的探讨慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）对大鼠神经元PKCymRNA及蛋白表达的影响.方法孕16d的SD大鼠,原代培养大鼠胚胎皮层神经元,随机分为3组,每组6孔,对照组（C组）：不行任何处理;阴性对照组（NC组）：每孔加入阴性对照慢病毒3×10^5... 详细信息

目的探讨慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）对大鼠神经元PKCymRNA及蛋白表达的影响.方法孕16d的SD大鼠,原代培养大鼠胚胎皮层神经元,随机分为3组,每组6孔,对照组（C组）：不行任何处理;阴性对照组（NC组）：每孔加入阴性对照慢病毒3×10^5个;RNAi组：每孔中加入编码PKCγ shRNA的慢病毒载体（LV-PKCγ shRNA）颗粒3×10^5个.5 d后采用RT-PCR和Western blot法检测PKCγ mRNA和蛋白的表达水平,并计算干扰效率.结果与C组比较,RNAi组大鼠神经元PKCγ mRNA及其蛋白表达水平均降低（P〈0.05）,NC组上述指标差异无统计学意义（P〉0.05）.基因干扰效率99.3%,蛋白干扰效率85.2%.结论慢病毒介导的RNAi可有效地下调大鼠原代神经元PKCγ基因及其蛋白的表达.

关键词： RNA干扰蛋白激酶C 慢病毒属神经元

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

FUS1基因慢病毒载体的构建

中华肿瘤防治杂志 2008年第4期15卷 241-243页

作者：张宝霍霞彭琳齐宗利徐锡金李燕郑良楷丘波汕头大学医学院中心实验室

目的:构建FUS1基因慢病毒载体,包装病毒,体外高效感染细胞。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入慢病毒载体pSL6-IRES-EGFP中,经PCR、酶切和测序鉴定后,与包装质粒共转染293T细胞,制备慢病毒。将病... 详细信息

目的:构建FUS1基因慢病毒载体,包装病毒,体外高效感染细胞。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入慢病毒载体pSL6-IRES-EGFP中,经PCR、酶切和测序鉴定后,与包装质粒共转染293T细胞,制备慢病毒。将病毒转染BEL7404和DLD-1细胞,观察病毒转染效果。结果:经过PCR测序鉴定,克隆了pSL6-FUS1-IRES-EGFP重组子;所包装的病毒对细胞的感染效率>90%。结论:成功地克隆FUS1基因于慢病毒载体,制备了高效感染细胞的慢病毒。

关键词：基因,肿瘤抑制基因,FUS1 慢病毒属转染

Smurf1基因靶向RNAi慢病毒载体的构建及转染

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

第二军医大学学报 2011年第10期32卷 1147-1150页

作者：袁恒锋何崇儒高金巍徐卫东第二军医大学长海医院骨科上海200433

目的构建Smad泛素调节因子1(Smurf1)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,观察其转染骨肉瘤U20S细胞后对Smurf1基因表达的抑制作用,为后续研究奠定基础。方法构建Smurf1基因过表达质粒,同时针对Smurf1基因序列设计合成4条RNAi片段并构建R... 详细信息

目的构建Smad泛素调节因子1(Smurf1)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,观察其转染骨肉瘤U20S细胞后对Smurf1基因表达的抑制作用,为后续研究奠定基础。方法构建Smurf1基因过表达质粒,同时针对Smurf1基因序列设计合成4条RNAi片段并构建RNAi慢病毒载体。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western印迹法进行外源筛靶,筛靶出成功的干扰质粒PSC2939。用慢病毒包装PSC2939后感染U20S细胞,进行内源验证,荧光定量PCR和Western印迹检测U20S细胞中Smurf1mRNA及蛋白的表达。结果经PCR及测序证实,Smurf1基因过表达载体及4种干扰载体均成功构建;Western印迹外源筛靶显示,PSC2939干扰载体能有效敲减目的基因的表达;慢病毒包装后的PSC2939干扰载体能有效抑制U20S细胞中Smurf1蛋白的表达,对Smurf1mRNA的抑制率达到60%以上。结论成功构建可供感染的Smurf1基因RNAi慢病毒载体,为进一步研究Smurf1基因在骨肉瘤细胞中的作用提供了有效的实验工具。

关键词： RNA干扰 Smurf1 骨肉瘤慢病毒属

shRNA下调基质金属蛋白酶9对脑梗死大鼠脑保护作用的扩散张量成像分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中华医学杂志 2018年第15期98卷 1176-1182页

作者：张勇程敬亮李娅郑州大学第一附属医院磁共振科 450002

目的通过对大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型脑缺血区组织的扩散张量成像（DTI）评价，探讨shRNA下调基质金属蛋白酶9（MMP-9）对脑梗死大鼠的脑保护作用。方法将32只SD大鼠随机分为4组（每组8只）：A组（假手术组）：仅分离结扎颈外动... 详细信息

目的通过对大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型脑缺血区组织的扩散张量成像（DTI）评价，探讨shRNA下调基质金属蛋白酶9（MMP-9）对脑梗死大鼠的脑保护作用。方法将32只SD大鼠随机分为4组（每组8只）：A组（假手术组）：仅分离结扎颈外动脉分支，不插入栓线；B组（MCAO组）：参照传统的Longa法，建立大鼠MCAO模型；C组（生理盐水组）：MCAO两周前给予脑组织内注射生理盐水5 μl；D组（慢病毒干预组）：MCAO两周前给予脑组织内注射慢病毒介导的shRNA 5 μl。MCAO后4、8、12、18、24 h时间点，计算脑梗死侧的表观扩散系数（ADC）值和部分各向异性（FA）值。Western印迹测定缺血侧脑组织MMP-9蛋白表达；免疫组化染色观测MMP-9蛋白表达。使用SPSS 17.0软件进行统计学处理，以P〈0.05为差异有统计学意义。结果缺血后4、8、12、18、24 h，慢病毒干预组缺血区的ADC值和FA值高于MCAO组，且差异有统计学意义（不同时间点ADC值差异的t值分别为8.78、3.30、3.58、4.55和13.12，P〈0.05。不同时间点FA值差异的t值分别为2.51、5.87、6.91、4.97和4.58，P〈0.05）。局灶性脑缺血后MMP-9蛋白表达逐渐增多；慢病毒干预组相应时间点的MMP-9蛋白的表达低于MCAO组，且在相应的每个时间点差异均具有统计学意义（不同时间点t值分别为3.55、6.11、4.67、4.63和2.77，均P〈0.05）。慢病毒干预组的mNSS评分低于MCAO组，差异有统计学意义（不同时间点t值分别为2.25、2.90、5.19、4.36和7.31，P〈0.05）。结论慢病毒介导的shRNA通过抑制MMP-9基因表达，减轻血管源性水肿，发挥脑梗死后的保护作用；磁共振DTI可动态监测缺血性脑梗死大鼠缺血区的改变。

关键词：基质金属蛋白酶9 慢病毒属梗塞大脑中动脉扩散张量成像

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

一种高效慢病毒转染小鼠肺方法的建立

军事医学 2019年第8期43卷 616-619页

作者：王蕾王晓英王玥付秋霞王东根詹林盛军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所北京100850 解放军总医院第六医学中心内分泌科北京100048 原海军机关门诊部北京100841 上海科技大学生命科学与技术学院上海200031

目的建立一种高效慢病毒转染小鼠肺的方法。方法采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和萤光素酶(luciferase,Luc)双基因标记慢病毒载体,通过293 FT细胞体外包装带有报告基因的慢病毒颗粒。选取BALB/c小鼠30只,每组15只,随... 详细信息

目的建立一种高效慢病毒转染小鼠肺的方法。方法采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和萤光素酶(luciferase,Luc)双基因标记慢病毒载体,通过293 FT细胞体外包装带有报告基因的慢病毒颗粒。选取BALB/c小鼠30只,每组15只,随机分为高压喷雾注射组和普通注射组,小鼠手术暴露气管,经气道注射报告基因标记的慢病毒颗粒,观察慢病毒转染至肺后2、4、6、8、10、12 h小鼠存活率和呼吸系统表现,并在转染后24 h体外活体荧光成像仪检测报告基因在小鼠体内的发光强度。结果荧光显微镜下观察,见多数细胞表达GFP,并见细胞融合现象,少量细胞悬浮,病毒滴度为5×107U/ml。活体荧光成像结果显示,与普通注射方法相比,高压喷雾注射组报告基因荧光强度均匀分布在肺中,荧光强度较高,两组间表达强度比较差异有统计学意义(P=0.0095);且高压喷雾注射组小鼠气促、鼻唇黏膜发绀(cyanosis)较普通注射组恢复快,两组12 h存活率分别为80%和50%。结论高压喷雾注射技术转染慢病毒颗粒至小鼠肺的技术更为高效,可用于建立外源基因小鼠肺转染模型。

关键词：慢病毒属转染高压喷雾注射绿色荧光蛋白质类萤光素酶类肺活体成像系统