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大鼠RNAi-A2aR慢病毒载体的构建及鉴定

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中华麻醉学杂志 2020年第7期40卷 800-804页

作者：夏韵 Mohamed Bassirou MY 周慧敏李婧凡陈超柯剑娟王焱林武汉大学中南医院麻醉科 430071 贵州医科大学附属医院麻醉科贵阳550004

目的构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3),在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo,shRNA慢病毒重组质粒构建成功后,将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞,从而获得病毒液。实验Ⅰ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组(n=6):空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组,各组分别转染MOI为10的相应病毒液,转染48 h时,Western blot法检测A2aR表达水平,确定干扰效率,以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组(n=36):空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组,各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体),于转染24、48和72 h时,采用CCK-8法测定细胞存活率,荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况,Western blot法检测A2aR表达水平,确定干扰效率。结果实验Ⅰ成功构建了2种shRNA-A2aR慢病毒载体(shRNA-A2aR 1、3)。shRNA-A2aR 3病毒液滴度为3.5×10^8 TU/ml。与V组和shRNA-A2aR 1组比较,shRNA-A2aR 3组心肌细胞A2aR表达下调(P慢病毒载体干扰效率73%。实验Ⅱ选择shRNA-A2aR 3慢病毒载体转染24 h时,各组细胞存活率均>85%;转染48 h时,MOI5组和MOI10组细胞存活率>80%;转染72 h各组细胞存活率70%。结论成功构建了大鼠shRNA-A2aR慢病毒载体,且MOI为10、转染48 h或MOI为20、转染24 h为最佳转染方案。

关键词：受体,腺苷A2A RNA干扰慢病毒属心肌细胞

含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定

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中国全科医学 2016年第24期19卷 2962-2966页

作者：索磊杨印祥栾佐南方医科大学第三临床医学院广东省广州市510515 中国人民解放军海军总医院儿科

目的体外构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体,并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效应。方法2015年3—11月,根据Gen Bank数据库中报道的人LINGO-1基因序列,设计合成针对人LINGO-1短发夹RNA(LINGO-1 shRNA)干扰序列,并将其克隆至重组质粒载体,测... 详细信息

目的体外构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体,并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效应。方法2015年3—11月,根据Gen Bank数据库中报道的人LINGO-1基因序列,设计合成针对人LINGO-1短发夹RNA(LINGO-1 shRNA)干扰序列,并将其克隆至重组质粒载体,测序验证后在293T细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组(实验组)和错配序列干扰载体组(对照组),并转染至人胶质细胞瘤细胞U251,荧光显微镜下观察其感染效率,并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)法检测LINGO-1 mRNA表达水平,采用Western blotting法检测LINGO-1表达水平。结果成功构建两组慢病毒干扰载体,经过包装分别得到滴度为2×108TU/ml和4×108TU/ml的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞U251后,实验组和对照组载体转染效率分别为96.6%、95.2%。免疫荧光染色显示,人胶质细胞瘤细胞U251高表达LINGO-1,经慢病毒载体转染后,实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组LINGO-1 mRNA表达水平(0.09±0.01)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=12.87,P<0.01),实验组LINGO-1 mRNA相对表达抑制率为91.0%。实验组LINGO-1表达水平(0.28±0.02)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=-8.13,P<0.01)。结论本研究成功构建了含人LINGO-1shRNA干扰载体,并证实了干扰载体对靶基因有较好的干扰效果,为研究LINGO-1在轴突再生中的作用奠定了基础。

关键词：慢病毒属 RNA干扰 LINGO-1

慢病毒介导artemin基因修饰的骨髓间充质干细胞对帕金森病大鼠的治疗作用

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中华神经科杂志 2015年第8期48卷 697-703页

作者：刘凯阴晓峰相恒伟邓文帅孙鹏青岛大学医学院临床系 266071 青岛大学医学院附属医院黄岛分院

目的探讨慢病毒介导的artemin（ARTN）基因修饰的骨髓间充质干细胞（MSCs）对帕金森病模型大鼠潜在性治疗作用及对脑内相关蛋白表达的影响.方法分离培养大鼠MSCs,将携带ARTN的慢病毒载体转染MSCs;6-羟多巴胺（6-OHDA）制备帕金森病大... 详细信息

目的探讨慢病毒介导的artemin（ARTN）基因修饰的骨髓间充质干细胞（MSCs）对帕金森病模型大鼠潜在性治疗作用及对脑内相关蛋白表达的影响.方法分离培养大鼠MSCs,将携带ARTN的慢病毒载体转染MSCs;6-羟多巴胺（6-OHDA）制备帕金森病大鼠模型,按随机数字表法随机分为假手术（Sham）组、帕金森病组、移植MSCs（MSCs）组、移植空病毒转染的MSCs（LV-MSCs）组、移植慢病毒介导的ARTN基因修饰的MSCs （LV-ARTN-MSCs）组,对帕金森病大鼠左侧纹状体进行细胞移植;术后2、4、6、8周,腹腔注射阿扑吗啡,进行行为学检测;采用Western印迹及免疫荧光法检测各组大鼠黑质酪氨酸羟化酶（TH）表达变化,移植ARTN修饰的MSCs在大鼠脑组织内表达;高效液相色谱仪检测各组大鼠纹状体内多巴胺、二羟基苯乙酸、高香草酸含量.结果 LV-ARTN-MSCs组在阿扑吗啡诱发下30 min内旋转圈数（179.33±18.74）明显低于帕金森病组、MSCs组和LV-MSCs组（235.83±18.95、203.67±11.50和206.33±11.86;q=8.828,P＜0.01;q=3.802,P＜0.05;q=4.219,P＜0.05）.LV-ARTN-MSCs组大鼠黑质TH阳性细胞百分比（64.05％±5.49％）显著高于帕金森病组（34.18％±3.35％）、MSCs组（52.59％±4.48％）和LV-MSCs组（50.57％±4.41％;q=13.280、5.135、6.028,均P＜0.01）,黑质TH蛋白表达也明显提高,同时慢病毒介导ARTN修饰的MSCs可以在帕金森病大鼠脑内存活至少6周,主要集中在移植侧的纹状体区.细胞移植8周后,MSCs组（2.34±0.54）、LV-MSCs组（2.28±0.45）、LV-ARTN-MSCs组（6.54±0.51）与帕金森病组（0.87±0.07）大鼠相比,纹状体多巴胺表达明显提高（q =5.233,P＜0.05;q=5.020,P＜0.01;q=20.190,P＜0.01）,以LV-ARTN-MSCs组最明显.结论纹状体移植慢病毒介导ARTN基因修饰的MSCs对帕金森病模型大鼠有一定的治疗作用.

关键词：帕金森病间质干细胞神经组织蛋白质类慢病毒属转染疾病模型,动物

慢病毒介导SOX9基因转染骨髓间充质细胞中的基因表达

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中国骨伤 2013年第7期26卷 597-600页

作者：白洁玉梁大川程鹏杨自权卫小春山西医科大学第二医院骨科山西太原030001

目的:构建携带小鼠SOX9基因的慢病毒载体,体外转染小鼠骨髓间充质细胞,观察小鼠SOX9基因在小鼠间充质细胞中的表达。方法:从含有小鼠SOX9基因的质粒提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增目的基因。连接目的基因与经Age-Ⅰ酶切线性化的慢病毒载... 详细信息

目的:构建携带小鼠SOX9基因的慢病毒载体,体外转染小鼠骨髓间充质细胞,观察小鼠SOX9基因在小鼠间充质细胞中的表达。方法:从含有小鼠SOX9基因的质粒提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增目的基因。连接目的基因与经Age-Ⅰ酶切线性化的慢病毒载体,转化感受态的大肠杆菌对质粒进行扩增,筛出阳性转化子,经293T细胞包装,收集病毒后,通过基因测序和限制性核酸内切酶酶切的方法对质粒进行鉴定。Lenti-SOX9-EGFP体外转染小鼠骨髓间充质细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染是否成功,并通过流式细胞仪测定转染效率。同时利用RT-PCR和Western Blot检测小鼠SOX9基因的表达。结果:成功构建了携带SOX9基因慢病毒载体,Lenti-SOX9-EGFP能高效转染小鼠骨髓间充质细胞。RT-PCR和Western Blot检测显示经SOX9基因转染的小鼠骨髓间充质细胞表达目的基因产物。结论:利用慢病毒介导SOX9基因成功地转染小鼠骨髓间充质细胞,而且SOX9基因在小鼠骨髓间充质细胞中得到表达,这为SOX9修复软骨损伤的进一步研究奠定了基础。

关键词：骨关节炎细胞介导免疫慢病毒属 SOX9基因骨髓间充质细胞

三种携带GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果

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中国组织工程研究 2017年第29期21卷 4642-4647页

作者：肖渝李彦林王坤李龙滕闫祥甲蒙旭晗昆明医科大学第一附属医院运动医学科云南省昆明市650000

背景:研究不同慢病毒对同一骨髓来源间充质干细胞的转染效果,筛选合适的细胞转染工具。目的:探究3种慢病毒对兔骨髓间充质干细胞转染效果的差异。方法:选择2周龄日本大耳白兔,髂骨穿刺抽取骨髓液,采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细... 详细信息

背景:研究不同慢病毒对同一骨髓来源间充质干细胞的转染效果,筛选合适的细胞转染工具。目的:探究3种慢病毒对兔骨髓间充质干细胞转染效果的差异。方法:选择2周龄日本大耳白兔,髂骨穿刺抽取骨髓液,采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志物表达。分别用p Tomo-GFP慢病毒、Ad-GFP慢病毒、lenti-GFP慢病毒转染骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测3种慢病毒的转染率。CCK-8法检测转染前后细胞生长活力变化。结果与结论:①培养出的细胞CD44阳性率为75.64%,CD34、CD45阳性率分别为6.14%、9.48%;②pTomo-GFP慢病毒转染后GFP表达率为2.64%、Ad-GFP慢病毒转染后GFP表达率为16.72%、lenti-GFP慢病毒转染后GFP表达率为45.24%;③各慢病毒对细胞生长存在一定影响。p Tomo-GFP、Ad-GFP在第1-8天对细胞生长潜伏期和对数生长期存在影响,可能对前期细胞活性造成一定干扰。短期内lenti-GFP对细胞生长影响不大,但第12天时出现了细胞生长情况变化,考虑对细胞远期活力存在影响;④选用lenti-GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞能够在保证细胞正常生长的情况下提供最大的转染效率,适用于兔骨髓间充质干细胞的示踪及基因转染等相关研究。

关键词：慢病毒属骨髓间质干细胞绿色荧光蛋白质类组织工程

慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞

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中国组织工程研究 2014年第32期18卷 5197-5202页

作者：尹秀茹裴凌梁佐迪中国医科大学附属第一医院辽宁省沈阳市110001

背景:基因治疗已成为疾病治疗的新趋势,为某些难治性疾病带来了曙光,合适的细胞、基因及载体的选择是治疗的关键。目的:探讨慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞应用于基因治疗的有效性和可行性。方法:从SD大鼠骨髓分... 详细信息

背景:基因治疗已成为疾病治疗的新趋势,为某些难治性疾病带来了曙光,合适的细胞、基因及载体的选择是治疗的关键。目的:探讨慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞应用于基因治疗的有效性和可行性。方法:从SD大鼠骨髓分离、培养、鉴定内皮祖细胞,采用构建的慢病毒载体(LV)将空载体(LV-eGFP)或骨形态发生蛋白2基因(LV-eGFP-BMP2)转染至内皮祖细胞,通过eGFP荧光检测转染效率。ELISA法检测上清液中骨形态发生蛋白2蛋白的分泌,Western blot法检测细胞骨形态发生蛋白2蛋白的表达,比较转染后细胞的迁移、增殖和抗凋亡能力。结果与结论:慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体的转染效率可达90%。与正常内皮祖细胞、转染空载体内皮祖细胞比较,转染骨形态发生蛋白2基因的内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白增加(P0.05),肿瘤坏死因子α损伤后的细胞凋亡率明显降低(P慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体可成功转染内皮祖细胞,转染后可增加内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白,增强对炎性损伤的抗凋亡能力,对迁移能力和增殖活性无明显影响。

关键词：内皮细胞骨形态发生蛋白质类慢病毒属转染干细胞培养内皮祖细胞骨形态发生蛋白2 慢病毒载体基因转染国家自然科学基金

人NOB1基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

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吉林大学学报（医学版） 2010年第2期36卷 258-261,I0001,I0002页

作者：林杨崔满华滕红许天敏吉林大学第二医院妇产科吉林长春130041

目的:构建人NOB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并在卵巢癌SKOV3和HEY细胞上鉴定其沉默效率。方法:针对NOB1基因设计特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLVTHM载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒载体在293T细胞包装成病毒颗粒,随后将其感染... 详细信息

目的:构建人NOB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并在卵巢癌SKOV3和HEY细胞上鉴定其沉默效率。方法:针对NOB1基因设计特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLVTHM载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒载体在293T细胞包装成病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3和HEY细胞,采用Real-timePCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率。结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到8×108PU.L-1。shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HEY细胞后NOB1基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了73.5%和82.2%。结论:成功构建NOB1基因的shRNA慢病毒表达载体,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。

关键词： NOB1 短发夹RNA 慢病毒属

慢病毒载体介导的neprilysin基因对小鼠神经干细胞的转导及表达

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中华神经科杂志 2013年第1期46卷 17-21页

作者：黄文莫雪安秦超郑金瓯梁志坚程道宾韦云飞广西医科大学附属第一医院神经内科南宁530021

目的观察慢病毒载体（lentiviralvector）介导的脑啡肽酶（Lenti-脑啡肽酶）基因对小鼠神经干细胞（NSC）转导及其表达的情况。方法利用Lenti-脑啡肽酶基因载体体外转导小鼠原代NSC，细胞免疫荧光染色和蛋白质印迹法分析NSC的蛋白表达... 详细信息

目的观察慢病毒载体（lentiviralvector）介导的脑啡肽酶（Lenti-脑啡肽酶）基因对小鼠神经干细胞（NSC）转导及其表达的情况。方法利用Lenti-脑啡肽酶基因载体体外转导小鼠原代NSC，细胞免疫荧光染色和蛋白质印迹法分析NSC的蛋白表达，酶联免疫吸附试验和高效液相色谱法检测NSC中脑啡肽酶蛋白对β-淀粉样蛋白l-40（Aβ1-40）的体外降解效率，不同组别之间差异比较采用t检验。结果Lenti一绿色荧光蛋白转导NSC后96h的成功转导率达90％以上。NSC转导脑啡肽酶基因后可同时表达脑啡肽酶和NSC的标记抗体Nestin或神经元的标记抗体微管相关蛋白2。随着细胞脑啡肽酶膜蛋白的浓度增加或孵育时间延长，脑啡肽酶降解Aβ1-40活性也增强。2．5μg（21．00±2．51）及1．0μg（15．00±0．54）脑啡肽酶蛋白降解活性较0．5Ixg（8．004-0．81）显著提高（t=40．4、12．7，均P〈0．01），phosphoramidon则明显抑制脑啡肽酶活性（0．5μg：0．08±0．01；1．0μg：0．044-0．01；2．5μg：0．05±0．01，与相等脑啡肽酶浓度比较，t=17．2、51．3和14．1，均P〈0．01）。孵育1、4和12h的脑啡肽酶降解率分别为11．4％、28．4％和93．7％。结论Lenti-脑啡肽酶基因可于体外成功转导小鼠NSC，移植脑啡肽酶基因转染的NSC具有潜在的治疗前景。

关键词：脑啡肽酶神经干细胞慢病毒属转染淀粉样β蛋白

核糖体蛋白S3a RNA干扰重组慢病毒载体的构建及其对细胞凋亡的影响

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第二军医大学学报 2015年第9期36卷 947-951页

作者：李英华王婧邱磊厉建中胡振林张俊平第二军医大学药学院生化药学教研室上海200433

目的构建小鼠核糖体蛋白S3a（RPS3a）特异性RNA干扰重组慢病毒载体（Lenti-shmRPS3a）,分析其对细胞凋亡的影响。方法设计针对小鼠RPS3amRNA的4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接入慢病毒载体系统pLLU2GeGFP中构建重组质粒,将重组... 详细信息

目的构建小鼠核糖体蛋白S3a（RPS3a）特异性RNA干扰重组慢病毒载体（Lenti-shmRPS3a）,分析其对细胞凋亡的影响。方法设计针对小鼠RPS3amRNA的4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接入慢病毒载体系统pLLU2GeGFP中构建重组质粒,将重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞组装病毒,检测病毒滴度。病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR和蛋白质印迹法检测干扰效果,流式细胞术分析其对凋亡的影响。结果 PCR和测序证明成功构建出LentishmRPS3a慢病毒载体,病毒滴度为（6~9）×107 TU/mL;RT-PCR表明Lenti-shmRPS3a的沉默效率高达72.64%,蛋白质印迹法证明RPS3a蛋白表达水平降低;流式细胞术证明感染了Lenti-shmRPS3a的细胞凋亡率较对照组升高（P〈0.05）。结论表达小鼠RPS3ashRNA的慢病毒载体能有效沉默RPS3a基因表达,促进细胞凋亡。

关键词：核糖体蛋白S3a RNA干扰慢病毒属细胞凋亡