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生产禽流感病毒的悬浮mdck细胞稳定性的研究

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生物技术通报 2020年第10期36卷 72-79页

作者：白春丽叶倩姬阿美刘旭平张旭刘志亮朱明龙赵亮谭文松华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 上海倍谙基生物科技有限公司上海201203 山东信得动物疫苗有限公司潍坊262204

旨为研究悬浮mdck细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性与病毒生产稳定性。以悬浮mdck细胞为研究对象,通过对该细胞进行了长达200多天的传代培养,考察了传代过程中各代次细胞的生长情况以及对H9N2禽流感病毒的生产能力差异;探究了不同培... 详细信息

旨为研究悬浮mdck细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性与病毒生产稳定性。以悬浮mdck细胞为研究对象,通过对该细胞进行了长达200多天的传代培养,考察了传代过程中各代次细胞的生长情况以及对H9N2禽流感病毒的生产能力差异;探究了不同培养基稀释比例和MOI等工艺参数条件对长期传代的悬浮mdck细胞生产H9N2禽流感病毒过程的影响关系;另外,从ROS水平和细胞周期两方面,研究了高低代次细胞的病毒生产能力差异的内在原因。结果显示,各代次悬浮mdck细胞形态相似,细胞生长能力无显著性差异,表明该细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性良好。但HA滴度随细胞代次的增加而增加,最高代次细胞(P111)的病毒滴度较最低代次细胞(P1)约高0.5 Log2HAU/100μL;P111细胞在不同工艺下病毒产量均高于P1细胞,表明了该细胞长期传代后病毒生产能力略有提高。最后,研究发现,与P1相比,P111胞内ROS水平较低并且G0/G1期细胞的比例较高,此现象可能是高代次细胞产量提高的原因。

关键词：悬浮mdck细胞禽流感病毒细胞株稳定性 ROS 细胞周期

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长期传代培养中悬浮mdck细胞生长与流感病毒生产稳定性

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长期传代培养中悬浮MDCK细胞生长与流感病毒生产稳定性

作者：白春丽华东理工大学

学位级别：硕士

犬肾细胞（Madin Darby Canine Kidney,mdck）作为流感病毒类疫苗生产最常用的细胞系之一。前人研究发现,贴壁mdck细胞作为连续细胞系在长期传代过程中会出现细胞形态、生长能力改变,流感病毒生产能力下降等不稳定问题。但更具应用价值... 详细信息

犬肾细胞（Madin Darby Canine Kidney,mdck）作为流感病毒类疫苗生产最常用的细胞系之一。前人研究发现,贴壁mdck细胞作为连续细胞系在长期传代过程中会出现细胞形态、生长能力改变,流感病毒生产能力下降等不稳定问题。但更具应用价值的无血清悬浮mdck细胞经长期传代后,其生产流感病毒过程的稳定性特征尚不明确。因此,有必要对长期传代培养过程中的悬浮mdck细胞形态、生长能力以及生产流感病毒过程的稳定性进行研究。本文以悬浮mdck细胞生产H9N2禽流感病毒过程为研究对象。首先,对实验室已有的悬浮mdck细胞进行长达200天以上传代培养,获得P1、P29、P63、P88、P111多个代次悬浮mdck细胞。在考察各代次细胞形态以及生长稳定性中,发现各代次细胞形态相似且良好,无明显结团现象;在传代培养以及批培养过程中5个代次细胞比生长速率、细胞直径、细胞活率之间无显著性差异,生长能力维持稳定。在病毒生产稳定性的考察中,以P1、P29、P88、P111共4个代次悬浮mdck细胞为研究对象,实验结果表明,血凝效价（HA滴度）与单细胞产毒率（Svy）均随着细胞代次的增加而增加,其中P111细胞最高HA滴度高于P1细胞0.47 Log2HAU/100 μ1。为进一步研究悬浮mdck细胞流感病毒生产不稳定的特性是否会受到病毒生产过程操作条件的影响,以最低代次细胞（P1）与最高代次细胞（P111）为研究对象,考察营养物、MOI、pH、乳酸等病毒生产操作条件对P1、P111产毒差异的影响。结果表明在各实验条件下,P111的HAmax与Svymax均高于P1细胞,HAmax差距为0.15-1.09 Log2HAU/100 μl,Svymax差距为3505.28-15779.11 virions/cell。实验结果表明高代次悬浮mdck细胞病毒高产的特性并不受生产过程操作条件的影响。以P1、P111细胞为研究对象,实验探究高低代次悬浮mdck细胞生产流感病毒过程的特征。结果表明,流感病毒生产早期,P111单个细胞的流感病毒颗粒释放速率高于P1细胞,其中在6-7 hpi时,该差距最大为1611.88 virions/cell/h。另外发现,P111细胞处于G0/G1期的细胞比例比P1细胞高约10%;P111胞内ROS水平却低于P1细胞,0 hpi、6 hpi分别为P1胞内ROS水平的47.00%、83.11%。借助转录组手段,对高低代次细胞基因表达水平进行分析,发现差异基因主要富集在MAPK、PI3K-Akt、胞吞作用、ABC转运蛋白信号通路。并且促进G0/G1期阻滞以及ROS清除相关蛋白基因出现显著变化。通过本文研究,确定了悬浮mdck细胞在长期传代过程中细胞生长以及流感病毒生产的稳定性,并初步探究了高低代次细胞产毒差异的原因。研究结果将为悬浮mdck细胞生产流感病毒工艺的开发提供重要的技术支持。

关键词：悬浮mdck细胞禽流感病毒细胞株稳定性 RNA-seq

悬浮与贴壁mdck细胞在流感病毒分离培养中的应用评价

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中华实验和临床病毒学杂志 2023年第6期37卷 637-642页

作者：周雪俞俊岭杨思天夏艺丹罗婉蓉方惟希胡敏昊何军安徽省疾病预防控制中心(安徽省公共卫生研究院) 合肥230601 安徽医科大学公共卫生学院合肥230000

目的比较悬浮细胞mdck和贴壁细胞mdck两种培养体系对流感病毒分离培养的差异,探讨悬浮细胞的应用前景。方法通过细胞计数记录两种细胞的活细胞密度和细胞特定生长速率,使用WHO推荐疫苗株进行病毒感染实验,连续传代5次后观察血凝效价并... 详细信息

目的比较悬浮细胞mdck和贴壁细胞mdck两种培养体系对流感病毒分离培养的差异,探讨悬浮细胞的应用前景。方法通过细胞计数记录两种细胞的活细胞密度和细胞特定生长速率,使用WHO推荐疫苗株进行病毒感染实验,连续传代5次后观察血凝效价并对HA和NA基因进行测序,观察基因突变情况。结果悬浮细胞的24 h、48 h活细胞密度较贴壁细胞更稳定;病毒连续传代培养至第三代时悬浮细胞培养的病毒HA滴度可达1∶256以上,而贴壁细胞则无滴度;悬浮细胞培养的H3N2和BV亚型流感病毒第四代和第五代HA基因各发生1个氨基酸位点突变,贴壁细胞两个代次内未发现基因突变,NA基因均未发现基因突变。结论悬浮mdck细胞较贴壁细胞生长更为稳定,且病毒分离培养效率高,连续传代病毒突变率低,在基于细胞培养技术的流感疫苗生产工艺中具备一定的可行性。

关键词：流感病毒悬浮mdck细胞贴壁mdck细胞病毒分离

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重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株培养条件的优化

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中国农业科学 2018年第17期51卷 3415-3426页

作者：李莉杜鑫张丽娜杨柳高晓庆唐东雪赵海源蒋晓梅张天舒李金祥吉林冠界生物技术有限公司新疆维吾尔自治区畜牧科学院新疆维吾尔自治区动物卫生监督所中国农业科学院

【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂... 详细信息

【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂、个体差异、培养周期长和不易放大培养等缺陷。而利用生物反应器大规模培养动物细胞生产病毒疫苗,不仅可以大幅度提高单位产量,实现高密度细胞和高病毒产率,同时可保证产品质量。目前我国用于禽流感防控的疫苗为重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)。国内细胞全悬浮工艺生产禽流感灭活疫苗单罐产能最大为6 000 L,高病毒含量抗原的提供是生产高效疫苗的主要影响因素之一。【目的】为了能够提供稳定的、高效的生产抗原,开展种毒驯化试验。【方法】将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株分别在mdck细胞及悬浮mdck细胞上增殖。在mdck细胞上通过不同的病毒接种剂量、不同收获时间、不同TPCK-胰酶浓度的试验,确定了H7N9 H7-Re1株在mdck细胞上最佳收获时间为64 h,最佳接毒剂量为0.008%或MOI为10-4,最佳TPCK-胰酶浓度为2μg·mL-1,根据确定的最佳培养条件连续传代,并对各代次病毒含量进行检测。【结果】在mdck细胞上传至第5代时,HA可达1﹕256,每1 mL病毒含量达到108.5TCID50,每0.1 mL病毒含量达到108.5EID50,均高于其他代次。【结论】将第5代确定为mdck细胞传代最佳代次,可考虑确定为生产用基础种毒代次。在悬浮mdck细胞上对重组禽流感病毒传代进行了优化试验,确定了H7N9 H7-Re1株在悬浮mdck细胞上最佳收获时间为48 h,最佳接毒剂量MOI为10-2,最佳TPCK-胰酶浓度为4—8μg·mL-1。在实际疫苗生产过程中,可选择mdck细胞或悬浮mdck细胞来扩繁种毒。

关键词：重组禽流感病毒 mdck细胞悬浮mdck细胞病毒含量