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恙虫病东方体Sta56抗原的原核表达、纯化及其在间接ELISA中的应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第5期23卷 397-400页

作者：邓艳琴严延生何似翁育伟陈亮福建省疾病控制中心福州350001

目的　构建含恙虫病东方体sta5 6基因的重组表达质粒 ,在E .coli中表达Sta5 6重组抗原 ,纯化后用于间接ELISA检测恙虫病。方法　从含有恙虫病东方体Karp株sta5 6基因的重组质粒TOPO sta5 6扩增出截短的sta5 6 ,定向插入pET30a载体 ,转... 详细信息

目的　构建含恙虫病东方体sta5 6基因的重组表达质粒 ,在E .coli中表达Sta5 6重组抗原 ,纯化后用于间接ELISA检测恙虫病。方法　从含有恙虫病东方体Karp株sta5 6基因的重组质粒TOPO sta5 6扩增出截短的sta5 6 ,定向插入pET30a载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS PAGE及Westernblot进行分析 ;采用电洗脱方法纯化重组抗原并应用于间接ELISA检测恙虫病。结果　以截短的sta5 6基因片段构建了重组表达质粒pETOt95 7,重组的Sta5 6抗原可在E .coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS PAGE显示了一条相对分子质量 (Mr)为 4 0 .3× 10 3 的蛋白表达带 ,West ernblot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别。电洗脱纯化的重组抗原应用于间接法ELISA检测恙虫病 ,与间接免疫荧光法IFAT比较 ,其敏感性和特异性分别为 91.7%和 76 .5 %。结论　在大肠杆菌中表达的Sta5 6重组抗原具有免疫反应性 ,纯化后可用作免疫诊断试剂。

关键词：恙虫病东方体 Sta56抗原蛋白表达蛋白纯化酶联免疫吸附实验

海南岛临床感染恙虫病东方体群体多态性及DNA载量研究

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海南岛临床感染恙虫病东方体群体多态性及DNA载量研究

作者：薛莉颖海南医学院

学位级别：硕士

目的:恙虫病是一种由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)感染引起的急性发热性疾病,主要通过携带病原体的恙螨幼虫叮咬传播。其临床特征主要为发热、头痛,临床表现从无症状到多器官衰竭差异很大。恙虫病传统流行范围主要为环太平洋... 详细信息

目的:恙虫病是一种由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)感染引起的急性发热性疾病,主要通过携带病原体的恙螨幼虫叮咬传播。其临床特征主要为发热、头痛,临床表现从无症状到多器官衰竭差异很大。恙虫病传统流行范围主要为环太平洋亚太地区(恙虫病三角区),近年来在非洲、南美洲也发现恙虫病感染病例,提示其流行范围不断扩大。本研究通过多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)方法对海南岛临床患者恙虫病东方体群体多态性进行了研究,利用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法对患者恙虫病东方体DNA载量进行定量分析,并与临床检查数据进行相关性分析。本研究为海南岛临床感染恙虫病东方体的分布和群体结构、恙虫病东方体致病性相关因子的研究提供重要的基础数据,为海南岛恙虫病的防治提供科学依据。方法:(1)基于MLST的海南岛临床患者恙虫病东方体群体多态性研究,采用基于gps A,mdh,nrd B,nuo F,ppd K,suc D,suc B这7个管家基因的MLST方法对2018年7月～2021年5月海南岛临床感染恙虫病患者样本进行群体遗传结构分析,并将其结果与Pub MLST比较,得出序列型并构建系统发育进化树,对海南岛临床患者恙虫病东方体群体多态性进行研究。对其中一名携带混合型MLST相关管家基因的患者的血液样本和焦痂样本进行分析,比较其血液样本和焦痂样本中恙虫病东方体群体结构的组成。(2)恙虫病东方体DNA载量与病情的相关性分析,通过以tsa 56 k Da基因为靶点的巢式PCR,筛查出2018年～2021年海南岛临床恙虫病阳性患者,然后对其阳性样本进行real-time PCR定量检测,得到恙虫病阳性患者血液样本DNA载量,结合其基因型、患者信息和临床指标对恙虫病东方体DNA载量与病情的相关性进行分析。结果:(1)利用基于7个管家基因的MLST方法成功对97例恙虫病阳性患者进行了分析,其中74例患者测序结果为单一基因型,23例患者为MLST混合基因型感染。本研究发现51个新的序列型(Sequence Typing,ST)和72个新的等位基因。通过goe BURST可视化分析海南岛STs,以七个基因座中有一个基因座或两个基因座不同为标准定义克隆复合体(clonal complex,CC),发现4对单基因座变异(Single locus variant,SLV)的CCs和43个未与其他任何ST相连接的菌株;与Pub MLST数据库中STs相比,海南岛STs与海南岛外已知的STs之间没有单基因座变异和双基因座变异(double locus variant,DLV)连接,未发现共同CC;以七个基因座中有两个以上基因座相同为标准来筛选STs之间的假设性相连时,所得结果为海南岛ST99、ST100、ST104、ST101、ST102、ST129、ST128与老挝和泰国的ST25有假设性相连,老挝的ST70、ST71、ST72、ST74和泰国的ST21,与海南岛发现的ST110有假设性相连,澳大利亚标准株Sido(ST45)与海南岛发现的ST106有假设性相连,这些相连的STs可能有共同的克隆起始(clonal founders)。结合进化树分析,结果表明海南岛最多的ST和相连的STs在同一分支且其tsa 56 k Da分型也相同,并且ST143型的样本均来自琼中黎族苗族自治县;MLST分型处于同一分支的STs在tsa 56 k Da分型中可能属于不同的基因型。其中23例患者的测序结果在多个位点出现双峰,将其定义为混合基因型感染,对其中一名患者血液样本和焦痂样本的gps A和mdh管家基因进行克隆验证,确认该患者存在混合感染,其血液样本和焦痂样本混合基因型比例一致,但其56k Da TSA分型检测未发现混合感染。(2)利用real-time PCR方法成功对135例恙虫病阳性患者血液DNA载量进行了定量,占巢式PCR阳性恙虫病患者的95.07%,表明我们新建立的real-time PCR方法具有较高的灵敏度。117名未用多西环素恙虫病患者O.tsutsugamushi DNA载量的中位数为3.11×10copies/m L,范围为44copies/m L～3.2×10copies/m L。海南岛恙虫病东方体基因型有Karp(54.70%)、Gilliam(37.61%)、TA763(6.84%)、Kato＿B(0.85%)。Karp组患者的DNA载量明显高于Gilliam组(P=0.01)和TA763组(P=0.001);黎族患者的DNA载量明显高于汉族(P=0.018);第二个季度恙虫病患者DNA载量明显高于第三季度(P=0.005)和第四季度(P=0.008);总胆红素TBil与DNA载量呈正相关(相关系数为0.454,P=0.015);患者体温与DNA载量呈正相关(相关系数为

关键词：恙虫病恙虫病东方体多位点序列分型 DNA载量相关性分析

恙虫病东方体56 kDa抗原基因片段在不同载体的表达

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中华流行病学杂志 2004年第11期25卷 973-977页

作者：邓艳琴严延生何似翁育伟陈亮福建省疾病预防控制中心福州350001

目的构建恙虫病东方体56kDa表面抗原基因(sta56)片段在不同载体的重组表达质粒,在E.coli中表达sta56重组抗原并比较不同表达系统对sta56的表达效果。方法从含有恙虫病东方体Karp株sta56基因的重组克隆,扩增出不同长度的截短的sta56片... 详细信息

目的构建恙虫病东方体56kDa表面抗原基因(sta56)片段在不同载体的重组表达质粒,在E.coli中表达sta56重组抗原并比较不同表达系统对sta56的表达效果。方法从含有恙虫病东方体Karp株sta56基因的重组克隆,扩增出不同长度的截短的sta56片段,定向插入pPROEX HTb及pET30a载体,转化大肠埃希菌DH5a或BL21(DE3),IPTG诱导表达,应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白表达情况,应用蛋白印迹(WB)方法分析重组抗原的活性。结果成功构建含sta56不同长度片段的重组表达质粒pHTbOt957、pHTbOt498、pHTbOt342和pETOt957、pETOt498、pETOt342,各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,SDS-PAGE显示各表达重组子表达不同分子量的重组蛋白,WB证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。结论恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠埃希菌获得高效表达,pET30a对sta56的表达效果优于pPROEX HTb;重组蛋白具有免疫反应性,纯化后可用作免疫诊断抗原。

关键词：恙虫病东方体 HT 表达重组抗原 Karp株 ET 重组蛋白原基重组子 a抗原

恙虫病东方体Sxh951株56kD蛋白的表达及其在ELISA中的应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第2期24卷 155-158页

作者：陈唯军牛东升张雪颖陈梅玲温博海陈香蕊军事医学科学院微生物流行病研究所

目的　构建含OrientiatsutsugamushiSxh95 1株 (Ot.Sxh95 1)相对分子质量 (Mr)为 5 6×10 3外膜蛋白基因 (sxh5 6 )的重组质粒pQE30 5 6 ,表达Mr5 6× 10 3蛋白并观察其在ELISA中的应用。方法　IPTG诱导sxh5 6重组质粒 ;观察SDS PAGE... 详细信息

目的　构建含OrientiatsutsugamushiSxh95 1株 (Ot.Sxh95 1)相对分子质量 (Mr)为 5 6×10 3外膜蛋白基因 (sxh5 6 )的重组质粒pQE30 5 6 ,表达Mr5 6× 10 3蛋白并观察其在ELISA中的应用。方法　IPTG诱导sxh5 6重组质粒 ;观察SDS PAGE和免疫印迹结果 ;经Ni NTA亲和层析纯化后的重组蛋白分别与Ot.Gilliam、Ot.Karp、Ot.Kato感染鼠血清进行ELISA和免疫印迹检测。结果　SDS PAGE和免疫印迹检测显示有一Mr 约为 5 6× 10 3的特异蛋白带 ;ELISA和免疫印迹结果显示该重组蛋白只与Ot.Gilliam感染鼠血清呈阳性反应 ;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测小鼠血清抗体IgG ,特异性为 10 0 % ,敏感性 96 .6 7% ;检测人血清抗体IgG的敏感性为 88.0 8% ,特异性 96 .36 %。结论　表达的重组Sxh5 6蛋白具有良好的免疫反应性 ;其作为ELISA包被抗原 ,具有良好的特异性和敏感性。

关键词：恙虫病东方体克隆免疫印迹 ELISA 免疫反应性重组质粒

恙虫病东方体山东分离株Sta56基因全序列扩增及酶切分析

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中华流行病学杂志 2007年第9期28卷 886-890页

作者：刘运喜张倩赵仲堂杨占清杨丽萍张泮河杨红袁云娥魏华索继江邢玉斌贾宁高岩曹务春解放军总医院北京100853 军事医学科学院微生物流行病研究所山东大学公共卫生学院济南军区联勤部疾病预防控制中心

目的明确山东恙虫病东方体(Ot)分离株Sta56基因全序列与其他已知的序列之间的遗传变异关系。方法对从山东省费县恙虫病患者、黑线姬鼠、小盾纤恙螨体内分离的3株Ot分离株Sta56基因全序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增;选取4种内切酶HinfⅠ... 详细信息

目的明确山东恙虫病东方体(Ot)分离株Sta56基因全序列与其他已知的序列之间的遗传变异关系。方法对从山东省费县恙虫病患者、黑线姬鼠、小盾纤恙螨体内分离的3株Ot分离株Sta56基因全序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增;选取4种内切酶HinfⅠ、HhaⅠI、HaeⅢ、PstⅠ对PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP);对代表株XDM2株Sta56基因全序列测序,运用Clustal X(5.0)和PHYLIP软件对测得的序列与GenBank中已知的Ot序列构建系统发育树,进行比较分析。结果患者分离株B-16、黑线姬鼠分离株FXS2和小盾纤恙螨分离株XDM2均扩增出接近1.6 kbp的目的条带。Ot山东分离株PCR扩增产物经HhaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、PstⅠ酶切后图谱一致,但与国际参考株Gilliam、Karp、Kato株的RFLP图谱均不相同;虽与日本地方株Kawasaki株的酶切图谱有相似之处,但存在酶切位点的突变。序列同源性分析结果显示,山东地区代表株XDM2株Sta56基因全序列与Kawasaki型相应的序列同源性最高,为97%,氨基酸序列同源性为92%。结论经Sta56基因全序列分析,Ot山东分离株基因型虽与日本Kawasaki型相似,但也存在差异。

关键词：恙虫病东方体基因,Sta56 核苷酸限制性片段长度多态性分析序列测定

恙虫病东方体感染对内皮细胞Tie2/Akt/Foxo1通路的影响

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中国人兽共患病学报 2020年第12期36卷 969-974页

作者：卫阳金迎迎梁越进邢燕西安交通大学第二附属医院中心实验室西安710015 美国得克萨斯大学医学院加尔维斯顿分部微生物与免疫系加尔维斯顿77555-1070 西安交通大学第二附属医院肿瘤放疗科西安710004 河南省人民医院儿科郑州450003

目的研究恙虫病东方体感染对Tie2/Akt/Foxo1通路的影响。方法本研究应用新建立的小鼠和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)严重恙虫病东方体感染模型,在感染的不同时间点收集小鼠肺脏组织或细胞,用Western blot法检测Tie2/Akt/Foxo1通路蛋白的表达... 详细信息

目的研究恙虫病东方体感染对Tie2/Akt/Foxo1通路的影响。方法本研究应用新建立的小鼠和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)严重恙虫病东方体感染模型,在感染的不同时间点收集小鼠肺脏组织或细胞,用Western blot法检测Tie2/Akt/Foxo1通路蛋白的表达,用RT-PCR法检测炎症因子mRNA的表达。结果感染后,小鼠肺脏血管生成素2(Ang2)表达升高,而Tie2和磷酸化Tie2(p-Tie2)水平显著下降。感染HUVEC的检测结果支持小鼠实验结果,即Ang2升高,而Tie2和p-Tie2降低;添加重组人源血管生成素1(Ang1)可以部分恢复Tie2的改变。进一步研究发现Tie2信号下游蛋白Akt磷酸化降低、Foxo1去磷酸化增加;Foxo1呈细胞核内积累,HMGB1及IFN-γ等炎症因子表达增加。同时发现恙虫病东方体感染HUVEC后,血管内皮生长因子受体2及钙粘素等细胞通透性相关蛋白表达也同Tie2一样降低。结论恙虫病东方体感染抑制Tie2/Akt/Foxo1信号的活化,而该信号在维持血管正常功能中起重要作用,提示Tie2可能是严重恙虫病治疗的一个潜在靶点。

关键词：恙虫病恙虫病东方体 Tie2

汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的组织细胞培养研究

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中华流行病学杂志 2006年第6期27卷 518-521页

作者：邓小昭许可孔晶刁振宇钱俊英谈永飞张矛曹广文张云南京军区联勤部军事医学研究所 210002 南京医科大学陕西省疾病预防控制中心江苏省宜兴市人民医院解放军第二军医大学

目的了解汉坦病毒(HV)和恙虫病东方体(Ot)在宿主体内共生情况。方法采用Vero E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内共生特征。结果5组感染Veto E6细胞体外培养检测结果发现:先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接... 详细信息

目的了解汉坦病毒(HV)和恙虫病东方体(Ot)在宿主体内共生情况。方法采用Vero E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内共生特征。结果5组感染Veto E6细胞体外培养检测结果发现:先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接种感染组在细胞传至第3代时检测均见有HV和Ot的双重感染,阳性率随传代次数增加而增加。而HV和Ot单纯分别感染组细胞传第2代时即可检测到HV和Ot,阳性率亦随传代次数的增加而增加。在传代培养中单纯感染组的阳性率均显著高于先后和同时感染组。其结果均用PCR和RT-PCR进行了基因鉴定。结论研究结果提示HV和Ot可在同一宿主细胞内共生,在感染初期有相互抑制作用;对HV和Ot的流行病学有一定的理论意义。

关键词：汉坦病毒恙虫病东方体宿主组织细胞

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我国恙虫病东方体分子流行病学研究进展

中华流行病学杂志 2014年第1期35卷 88-92页

作者：张鲁燕毕振旺赵仲堂山东大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系济南250012 山东省疾病预防控制中心

恙虫病是由恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi，Ot）引起的以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为主要临床表现的一种自然疫源性疾病。在我国恙虫病流行原仅限于长江以南广大地区，但自1986年以来，秋冬型恙虫病作为一种新发传染... 详细信息

恙虫病是由恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi，Ot）引起的以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为主要临床表现的一种自然疫源性疾病。在我国恙虫病流行原仅限于长江以南广大地区，但自1986年以来，秋冬型恙虫病作为一种新发传染病，于我国北方地区出现暴发和流行。

关键词：恙虫病东方体分子流行病学

天津市农牧地区2007-2009年莫氏立克次体、横赛巴尔通体、恙虫病东方体血清流行病学调查

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中华流行病学杂志 2011年第3期32卷 256-259页

作者：张颖张之伦阴杰莹吕杰禹惠兰梁长威王誓闻赵景波张丽娟天津市疾病预防控制中心 300011 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所无形体室哈尔滨医科大学公共卫生学院

目的分析天津市农牧地区高危人群蚤传及螨传立克次体病流行趋势.方法 2007-2009年,利用现场流行病学调查方法,以农户为单位随机调查天津地区直属的8个区（县）从事农牧业的人群,并现场采集886份血液标本,采用微量间接免疫荧光检测人群... 详细信息

目的分析天津市农牧地区高危人群蚤传及螨传立克次体病流行趋势.方法 2007-2009年,利用现场流行病学调查方法,以农户为单位随机调查天津地区直属的8个区（县）从事农牧业的人群,并现场采集886份血液标本,采用微量间接免疫荧光检测人群莫氏立克次体、横赛巴尔通体及恙虫病东方体特异IgG抗体,并分析比较不同年份、地区、性别及年龄组人群抗体阳性率变化趋势.结果 3种立克次体抗体阳性率均呈上升趋势.其中莫氏立克次体阳性率变化范围为5.0%～58.2%;横赛巴尔通体为2.6%～14.5%;恙虫病东方体为1.8%～39.8%.3种病原体阳性率较高的地区主要集中在天津市东南部及中部近海低海拔地区.结论天津地区农牧人群普遍存在蚤传及螨传立克次体感染,并且有逐年上升趋势.

关键词：莫氏立克次体横赛巴尔通体恙虫病东方体血清流行病学