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恙虫病东方体LAMP可视化快速检测方法的建立

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疾病监测 2023年

作者：曾志伟韩腾伟刘维俊刘菁徐国英王加熊周淑姮福建省疾病预防控制中心福建省人兽共患病研究重点实验室

目的利用环介导等温扩增（LAMP）可视化检测技术，建立一种灵敏、特异和简便的恙虫病检测方法。方法利用LAMP在线引物设计软件PrimerExplorerV4，以恙虫病东方体热休克蛋白groEL基因作为靶序列，设计扩增引物，优化反应条件。利用恙... 详细信息

目的利用环介导等温扩增（LAMP）可视化检测技术，建立一种灵敏、特异和简便的恙虫病检测方法。方法利用LAMP在线引物设计软件PrimerExplorerV4，以恙虫病东方体热休克蛋白groEL基因作为靶序列，设计扩增引物，优化反应条件。利用恙虫病东方体标准株评估灵敏度和特异度；收集42份恙虫病血样，分别采用LAMP、普通PCR和实时荧光定量PCR方法进行验证。结果建立的LAMP方法可在61～65 ℃80min内完成恙虫病东方体的快速检测，最低检测限为10 copies/μL，高于普通PCR方法2个数量级，高于荧光定量PCR方法1个数量级；对8种常见的自然疫源性疾病病原体检测均为阴性，特异度为100%；对42份恙虫病血样采用3种方法检测，阳性率一致，均为21.4%（9/42）。结论本研究建立的恙虫病东方体LAMP可视化检测反应快速，操作简便，灵敏特异，可在基层医疗卫生机构运用推广。

关键词：恙虫病东方体环介导等温扩增 groEL基因可视化检测

恙虫病东方体TSA、HtrA蛋白抗原性探究及其感染小鼠细胞因子风暴的初步研究

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恙虫病东方体TSA、HtrA蛋白抗原性探究及其感染小鼠细胞因子风暴...

作者：温萌安徽医科大学

学位级别：硕士

恙虫病是由节肢动物传播的革兰阴性专性细胞内细菌恙虫病东方体引起的严重威胁公共卫生安全的人畜共患病。其在亚太地区广泛流行,从阿富汗延伸到中国、朝鲜、西南太平洋岛屿和澳大利亚北部,每年导致100万人患病,威胁着全球近10亿人的健... 详细信息

恙虫病是由节肢动物传播的革兰阴性专性细胞内细菌恙虫病东方体引起的严重威胁公共卫生安全的人畜共患病。其在亚太地区广泛流行,从阿富汗延伸到中国、朝鲜、西南太平洋岛屿和澳大利亚北部,每年导致100万人患病,威胁着全球近10亿人的健康。非洲和南美国家的血清学证据表明,该疾病的地理范围和风险群体的人口可能更大。我国属于恙虫病重点疫区之一,发病率较高,死亡率在1.4%-6%之间严重威胁我国人民的健康。既往研究提示,恙虫病在我国北纬31°以南的广大地区流行,具有显著的季节特征,以夏季型为主。自1986年首次报道恙虫病在山东流行以来,新疫区不断形成和扩散,该类地区流行季节也与南方地区不同,为秋冬季,导致疾病特点发生了较大变化,恙虫病东方体的遗传背景、致病特点、毒力强度也可能发生了变异,并且逐渐向致病力较强的菌株发展。立克次体类疾病主要引起发热、皮疹、淋巴结肿大等症状,其临床特征不能有效区别于其他发热性疾病,常误诊导致病情加重,从而引发多器官损害等致命性疾病。鉴于恙虫病东方体在常规实验室条件下难以稳定培养和传代,对实验室培养条件和实验人员的要求较高,该菌株的培养不仅需要大量的正常细胞来获取分离菌株,而后续的相关研究更需要大量的纯化菌株,以上等综合原因使得国内研究者较少,而国际上对于恙虫病的致病机理研究极其稀少,目前我国对其致病机制的研究也尚属空白,因此建立经济且快速的诊断方法至关重要。本研究试图建立一种灵敏度与特异性相对较高且易于操作的恙虫病快速诊断方法,同时为了从根本上消灭恙虫病东方体感染,寻找合适的靶点来进行疫苗的开发,本研究通过建立小鼠动物模型来模拟疾病的感染过程,以期为恙虫病的防治提供一定的借鉴意义。本课题着重开展了四个部分的研究:第一部分研究根据恙虫病东方体外膜蛋白TSA以及HtrA基因序列设计特异性引物,构建TSA、HtrA基因的克隆与原核表达载体,进行两种蛋白的诱导表达及条件优化。结果显示构建了TSA及HtrA蛋白体外稳定表达的大肠杆菌菌株,同时纯化得到较高的蛋白浓度,为后续的进一步实验奠定了基础。第二部分研究初步建立恙虫病东方体病原检测方法,胶体金快速检测方法:将保存的能够用稳定表达TSA、HtrA蛋白的大肠杆菌菌株复苏,进行蛋白诱导表达纯化,体外获得纯度较高的蛋白后,利用胶体金进行标记,并对所建立的方法进行初步评价,结果显示利用临床确诊标本及健康人的标本进行验证,发现该方法具有较高的准确性,且大大缩短了检测时间与检测成本。免疫荧光抗原片检测方法:将保存的恙虫病东方体菌种复苏,感染L929细胞,制备细胞悬液后抗体孵育制作检测抗原片,初步结果显示该方法成本较低且具有良好的准确性。第三部分初步研究TSA、HtrA的抗原性,分别用两种蛋白刺激HUVECs细胞,观察TSA、HtrA对HUVECs细胞表型的影响,同时利用荧光定量PCR检测相关细胞因子的变化。结果显示,与对照组相比实验组的相关细胞因子水平显著升高。第四部分恙虫病东方体感染小鼠模型的构建及其引起的细胞因子风暴:首先将保存的恙虫病东方体菌株复苏,感染L929细胞多次优化培养条件使其能够大量克隆。收集细胞培养物反复多次进行细胞破碎后进行差速离心超纯后得到高浓度的立克次体悬液,最终进行定量浓度为1×10copies/μl,通过腹腔接种途径感染I型干扰素敲除小鼠及天然免疫缺陷TLR4小鼠,记录小鼠体征、体温、体重等基本信息,同时采集血液和脏器标本。通过病理切片HE染色、荧光定量PCR、免疫组织化学染色等方法进行相关指标检测,结果显示与对照组相比,I型干扰素敲除实验组的小鼠的活动度等指标在感染后的第八天出现显著变化,且在感染后的第十天发生死亡,TLR4受体天然缺陷组的小鼠活动度及状态未见明显差异,同时结合HE染色、免疫组化结果,实验组小鼠出现明显的炎症细胞浸润,细胞炎性因子水平较高。本研究成功于体外表达了恙虫病东方体两种特异性蛋白,初步建立了基于恙虫病东方体TSA蛋白的胶体金快速检测方法和免疫荧光抗原片法的临床诊断,为临床实验室确诊恙虫病及立克次体类疾病提供了快速有效的技术手段。TSA、HtrA蛋白对HUVECs细胞产生致病性,为进一步探究立克次体类胞内菌的致病机制奠定了基础,而小鼠模型的建立,肺部及脾脏的损伤由于恙虫病东方体感染后的患者表现类似,可作为恙虫病东方体致病性研究的体内模型,结合不同小鼠模型的情况对立克次体感染动物的致病性进行初步探究。

关键词：恙虫病东方体立克次体胶体金检测 TSA蛋白 HtrA蛋白细胞实验动物模型 HUVECs细胞

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恙虫病东方体小鼠损伤模型与系统地理的重建

恙虫病东方体小鼠损伤模型与系统地理的重建

作者：孔逸尘大理大学

学位级别：硕士

【目的】为了了解分离自啮齿动物和人的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)56 k Da外膜蛋白的分子特征,Ot小鼠感染模型所引起的病理改变,Ot中国与全球系统地理的重建,为恙虫病的防治提供科学指导。【方法】2020年8月-2021年8月,... 详细信息

【目的】为了了解分离自啮齿动物和人的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)56 k Da外膜蛋白的分子特征,Ot小鼠感染模型所引起的病理改变,Ot中国与全球系统地理的重建,为恙虫病的防治提供科学指导。【方法】2020年8月-2021年8月,在大理市采集啮齿动物以及疑似恙虫病病人样本,通过巢氏PCR扩增Ot保守基因,将啮齿动物阳性样品以及通过临床资料和分子实验筛选出不同基因型的Ot,采用小鼠腹腔接种法分离Ot。分离到的Ot用吉姆萨染色和间接免疫实验法进行鉴定,设计引物扩增Ot的56k Da型特异性抗原(type-specific antigen,TSA)基因全长,用MEGAⅩ、DNAStar 7.1、Seq Man、Tree Time等生物信息学软件,对本研究获得的Ot序列与全国和全球序列进行同源性、遗传进化、分化时间和突变进行系统分析。【结果】共捕获啮齿动物5属6种76只,从1只黄胸鼠(Rattus tanezumi)组织研磨液中扩增出了Ot序列,阳性率为2.38%(1/42),通过小鼠腹腔接种法分离到该株Ot,通过分子鉴定为TA763型,56 k Da TSA基因核苷酸序列全长为1566bp。在108份疑似恙虫病病人中,检出阳性率为70.37%(76/108),其中从患者身上分离出Karp,TA763,Kawasaki 3种基因型Ot,进化程度上与全球同型Ot在核苷酸水平上的相似度为95.60%～99.94%。在小鼠腹腔内接种感染剂量的Ot15天后,观察到实验组的肝脏和脾脏与对照组相比明显增大。3种基因型Ot的谷草转氨酶、谷丙转氨酶组间无差异,均显著高于对照组。肝组织可见肝细胞水肿,典型肝细胞气球样变。在毛细血管和胆管周围,有大量的淋巴细胞。免疫组化可见脾功能亢进、Ot堆积。在心脏、肺、肾脏和大脑中,主要表现为间质炎症。3种基因型恙虫病感染发生相同病理变化。系统地理重建结果显示:在中国范围内,台湾省被确定为恙虫病传播的主要枢纽;在全球范围内,中国又被确定为恙虫病传播枢纽,且保持着Ot最多的基因型。【结论】(1)在56 k Da分子学上没有发现恙虫病东方体在不同宿主之间存在差异。(2)在感染恙虫病的小鼠模型的多个器官中发现了炎性细胞浸润的现象。(3)56 k Da保守区的一致性是恙虫病感染发生相同病理变化的原因之一,为我们今后研制恙虫病疫苗提供了理论依据。(4)中国是恙虫病传播的重要枢纽,云南是中国恙虫病传播的第二枢纽。

关键词：恙虫病东方体丛林斑疹伤寒 56 kDa 动物模型

恙虫病东方体感染对内皮细胞Tie2/Akt/Foxo1通路的影响

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中国人兽共患病学报 2020年第12期36卷 969-974页

作者：卫阳金迎迎梁越进邢燕西安交通大学第二附属医院中心实验室西安710015 美国得克萨斯大学医学院加尔维斯顿分部微生物与免疫系加尔维斯顿77555-1070 西安交通大学第二附属医院肿瘤放疗科西安710004 河南省人民医院儿科郑州450003

目的研究恙虫病东方体感染对Tie2/Akt/Foxo1通路的影响。方法本研究应用新建立的小鼠和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)严重恙虫病东方体感染模型,在感染的不同时间点收集小鼠肺脏组织或细胞,用Western blot法检测Tie2/Akt/Foxo1通路蛋白的表达... 详细信息

目的研究恙虫病东方体感染对Tie2/Akt/Foxo1通路的影响。方法本研究应用新建立的小鼠和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)严重恙虫病东方体感染模型,在感染的不同时间点收集小鼠肺脏组织或细胞,用Western blot法检测Tie2/Akt/Foxo1通路蛋白的表达,用RT-PCR法检测炎症因子mRNA的表达。结果感染后,小鼠肺脏血管生成素2(Ang2)表达升高,而Tie2和磷酸化Tie2(p-Tie2)水平显著下降。感染HUVEC的检测结果支持小鼠实验结果,即Ang2升高,而Tie2和p-Tie2降低;添加重组人源血管生成素1(Ang1)可以部分恢复Tie2的改变。进一步研究发现Tie2信号下游蛋白Akt磷酸化降低、Foxo1去磷酸化增加;Foxo1呈细胞核内积累,HMGB1及IFN-γ等炎症因子表达增加。同时发现恙虫病东方体感染HUVEC后,血管内皮生长因子受体2及钙粘素等细胞通透性相关蛋白表达也同Tie2一样降低。结论恙虫病东方体感染抑制Tie2/Akt/Foxo1信号的活化,而该信号在维持血管正常功能中起重要作用,提示Tie2可能是严重恙虫病治疗的一个潜在靶点。

关键词：恙虫病恙虫病东方体 Tie2

恙虫病发生多器官功能障碍临床特征及危险因素分析

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中华急诊医学杂志 2022年第8期31卷 1138-1142页

作者：刘雄蔺际 福建医科大学第三临床医学院福州350122 厦门大学附属第一医院急诊部厦门361000 厦门市急诊急救质量控制中心厦门361000

恙虫病(scrub typhus)是由恙虫病东方体(orientia tsutsugamushi,Ot)引起的自然疫源性疾病,近1/3患者发生多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1,2,3,4],整体病死率约为12.7%[5],重症患者可高达30%[6]。因而早期识别和预测重症患者发生MODS对诊治恙虫病非常关键。故,本文通过回顾性分析近年来本院收治的恙虫病患者临床特征,尝试寻找恙虫病发生MODS的危险因素并建立预测模型,期望为临床诊治工作提供帮助。

关键词：多器官功能障碍恙虫病东方体自然疫源性疾病患者临床特征重症患者 MODS 早期识别危险因素

mNGS在15例海南危重型立克次体病早期救治中的价值

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中华检验医学杂志 2023年第2期46卷 137-142页

作者：高慧林锋杨旭颖黄涛吴涛海南医学院附属海南医院感染科海口570311 予果生物科技(北京)有限公司北京100176 海南医学院附属海南医院检验科海口570311

目的探讨宏基因组二代测序(mNGS)在危重型不典型的立克次体感染者早期救治中的应用价值。方法收集2020年1月至2022年8月在海南省人民医院住院治疗临床诊断危重症立克次体患者的临床特征、血生化结果、外斐反应结果、影像学资料及mNGS结... 详细信息

目的探讨宏基因组二代测序(mNGS)在危重型不典型的立克次体感染者早期救治中的应用价值。方法收集2020年1月至2022年8月在海南省人民医院住院治疗临床诊断危重症立克次体患者的临床特征、血生化结果、外斐反应结果、影像学资料及mNGS结果,进行回顾性分析,使用Fisher精确性检验比较mNGS和外斐反应的阳性率。结果15例立克次体病患者中均有发热症状,头痛12例,但具有诊断意义的典型皮疹或焦痂仅为3例,发生脓毒症休克6例,多器官功能障碍15例;血液mNGS阳性15例,其中10例患者在血液中检测出普氏立克次体(恙虫病东方体),其余5例检测出莫氏立克次体,mNGS阳性率显著高于外斐反应(15/15比0,P<0.001)。所有患者在确诊后均被给予多西环素等治疗,其中14例好转出院,1例因病情危重、放弃治疗出院后1周死亡。结论mNGS能够提高常规检测结果为阴性的非典型立克次体的检出率,可为危重型立克次体病患者早期诊断、早期抗感染治疗提供参考。

关键词：立克次体属二代测序恙虫病东方体休克、脓毒性多器官功能障碍

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恙虫病临床诊疗专家共识

中国人兽共患病学报 2024年第1期40卷 1-6页

作者：中国微生物学会人兽共患病病原学专业委员会中国医药生物技术协会生物诊断技术分会姜天俊辛德莉江佳富齐文杰谷丽王磊孙龙不详解放军总医院第五医学中心感染病医学部首都医科大学附属北京友谊医院军事医学研究院微生物流行病研究所首都医科大学附属北京朝阳医院海南医学院第一附属医院

恙虫病是由恙虫病东方体感染引起的一种自然疫源性疾病,流行于东亚和东南亚地区,主要表现为发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹。恙虫病早期症状不典型,容易误诊和漏诊。中国微生物学会人兽共患病病原学专业委员会和中国医药生物技术... 详细信息

恙虫病是由恙虫病东方体感染引起的一种自然疫源性疾病,流行于东亚和东南亚地区,主要表现为发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹。恙虫病早期症状不典型,容易误诊和漏诊。中国微生物学会人兽共患病病原学专业委员会和中国医药生物技术协会生物诊断技术分会相关专家,根据领域相关研究进展和诊疗经验,并参考国内外相关文献与指南,结合我国临床实践与咨询论证,形成本共识。

关键词：恙虫病恙虫病东方体临床诊疗专家共识

2022年浙江省宁波市1例恙虫病东方体Boryong基因亚型感染病例调查分析

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疾病监测 2023年第10期38卷 1264-1267页

作者：徐可叶平国华宁波市疾病预防控制中心微生物检验所浙江宁波315099

目的对2022年1例恙虫病疑似病例进行实验室检测和分析,了解浙江省宁波市恙虫病东方体基因型流行情况。方法对疑似病例进行流行病学调查,询问其病史;采集病例发热期血液,提取总DNA采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因tsa56,根据测得的... 详细信息

目的对2022年1例恙虫病疑似病例进行实验室检测和分析,了解浙江省宁波市恙虫病东方体基因型流行情况。方法对疑似病例进行流行病学调查,询问其病史;采集病例发热期血液,提取总DNA采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因tsa56,根据测得的序列构建系统进化树,确定该恙虫病东方体基因型。结果实时荧光定量PCR方法检出病例血液中存在恙虫病东方体;扩增序列经比对后与已知恙虫病东方体Boryong具有最近亲缘关系。结论宁波市实验室确诊1例恙虫病东方体感染病例,为Boryong基因亚型。

关键词：恙虫病恙虫病东方体 Boryong基因亚型进化分析

云南省大理市黄胸鼠恙虫病东方体的分离、鉴定及56 kDa型特异性抗原基因特征的研究

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中国媒介生物学及控制杂志 2022年第4期33卷 503-509页

作者：孔逸尘田佳伟杨字殷红敏黄皓陈利张云智大理大学公共卫生学院大理大学预防医学研究所云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室(培育)云南省高校人兽共患病跨境防控与检疫重点实验室云南大理671000 昆明医科大学公共卫生学院云南昆明650000

目的从云南省大理市啮齿动物中分离和鉴定恙虫病东方体(Orientia tsutsugamsushi,Ot),并对分离到的Ot 56 kDa型特异性抗原(56 kDa TSA)基因全长进行扩增分析。方法2020年8月-2021年8月采用夹夜法,在大理市4个乡(镇)采集啮齿动物样本,巢... 详细信息

目的从云南省大理市啮齿动物中分离和鉴定恙虫病东方体(Orientia tsutsugamsushi,Ot),并对分离到的Ot 56 kDa型特异性抗原(56 kDa TSA)基因全长进行扩增分析。方法2020年8月-2021年8月采用夹夜法,在大理市4个乡(镇)采集啮齿动物样本,巢氏PCR扩增Ot保守基因,阳性样品采用小鼠腹腔接种法分离Ot。分离到的Ot用吉姆萨染色观察和间接免疫荧光试验进行鉴定,设计引物扩增Ot的56 kDa TSA全长,用MEGA Ⅹ、DNAStar 7.1、SeqMan等生物信息学软件进行同源性与遗传进化分析。结果共捕获啮齿动物5属6种76只,从1只黄胸鼠肝、脾组织研磨液中扩增出了Ot序列,阳性率为2.38%(1/42)。分离和鉴定了1株Ot,命名为DALIV8。该分离株56 kDa TSA基因全长1566 bp,编码521个氨基酸(GenBank:OM914742)。DALIV8株56 kDa TSA基因在核苷酸水平与Kawasaki、Boryong、Karp、Kato、TA763基因型相似性为82.30%~98.85%,在氨基酸水平相似性为74.04%~98.28%。该Ot分离株为TA763基因型。结论云南省大理市黄胸鼠Ot分离株DALIV8,经对其56 kDa TSA基因的分子鉴定,确定为云南省首次分离获得Ot TA763基因型。

关键词：恙虫病东方体分离鉴定基因特征大理