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CHD4基因表达对急性t淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定

南京医科大学学报（自然科学版） 2021年第3期41卷 331-338页

作者：杨彩霞陆超南京医科大学第一附属医院儿科江苏南京210029

目的:探讨人染色质解旋酶DNA结合蛋白4(recombinant chromodomain helicase DNA binding protein 4,CHD4)基因表达对急性t细胞淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定。方法:使用siRNA-CHD4瞬时转染t淋巴细胞白血病细胞(Jurk... 详细信息

目的:探讨人染色质解旋酶DNA结合蛋白4(recombinant chromodomain helicase DNA binding protein 4,CHD4)基因表达对急性t细胞淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定。方法:使用siRNA-CHD4瞬时转染t淋巴细胞白血病细胞(Jurkat)敲低CHD4基因表达,实时荧光定量q Rt-PCR和Western blot检测细胞转染后CHD4表达量,流式细胞术测定细胞凋亡率及细胞周期变化;CCK-8分析测定CHD4基因对Jurkat细胞增殖的影响。根据生物信息学分析,以Jurkat细胞提取的全基因组DNA为模板,PCR扩增CHD4基因候选启动子区2 091 bp片段,以pGL3-Basic为载体,克隆含有CHD4基因候选启动子区的序列,制备重组质粒,并且构建一系列含CHD4基因候选启动子5′侧翼区截短序列质粒。将含CHD4启动子序列的质粒及截短序列质粒转染至Jurkat细胞和人胚胎肾t细胞(HEK293t),双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,确定CHD4基因启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析该区域转录因子结合位点,构建结合位点突变的质粒,通过双荧光素酶报告基因检测,分析结合位点对CHD4转录的影响。结果:流式细胞检测结果发现,与对照组比较,CHD4抑制Jurkat细胞凋亡,转染siRNA-CHD4的Jurkat细胞G0/G1期比例显著升高,而S期比例下降(Pt细胞的增殖有促进作用(Pt细胞凋亡有抑制作用,并且促进其增殖。CHD4最小活性区域位于转录起始位点-233~-13 bp,转录因子NF-κB对CHD4基因启动子活性具有正向调控作用。

关键词：急性t细胞淋巴细胞白血病凋亡染色质解旋酶DNA结合蛋白4(CHD4) 启动子转录因子

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白藜芦醇抗小鼠急性t淋巴细胞白血病的自噬作用机制研究

白藜芦醇抗小鼠急性T淋巴细胞白血病的自噬作用机制研究

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作者：杨二换河北医科大学

学位级别：硕士

目的:通过观察自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ及AMPK/m tOR信号通路中信号分子的表达水平,探讨白藜芦醇对急性t淋巴细胞白血病(t-ALL)小鼠自噬作用的影响及其可能机制。方法:1.将15只6周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(CON)... 详细信息

目的:通过观察自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ及AMPK/m tOR信号通路中信号分子的表达水平,探讨白藜芦醇对急性t淋巴细胞白血病(t-ALL)小鼠自噬作用的影响及其可能机制。方法:1.将15只6周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(CON)、t-ALL模型组(t-ALL)和白藜芦醇(100 mg/kg/d)处理组(Res),每组5只。t-ALL组和Res组小鼠尾静脉注射ICN1-GFR+t-ALL细胞,构建t-ALL白血病小鼠模型。2.采用流式细胞术(FCM)检测各组小鼠外周血及脾脏组织中GFR+t-ALL细胞的百分比。3.采用HE染色法观察各组小鼠脾脏病理组织学改变。4.采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)检测各组小鼠脾脏组织中信号分子Beclin1 m RNA表达水平。5.采用Western blot法检测各组小鼠脾脏组织中自噬相关蛋白(Beclin1、P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ)以及AMPK/m tOR通路相关蛋白(p-AMPK/AMPK、p-m tOR/m tOR)的变化。结果:1.t-ALL组小鼠精神萎靡不振、消瘦、步态不稳,Res组小鼠精神状态及饮食活动等均较t-ALL组有明显的改善;***结果显示:与t-ALL组相比,Res组小鼠外周血和脾脏中GFP+t-ALL细胞的百分比均明显减少(Pt-ALL细胞对小鼠脾脏组织的浸润及破坏;***-PCR结果显示,白藜芦醇组小鼠脾脏组织中Beclin1 m RNA水平明显高于t-ALL对照组(Pt结果显示:与t-ALL组相比,Res组小鼠脾脏中自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达水平显著升高(PtOR/m tOR水平明显下降(P细胞自噬水平发挥抗急性t淋巴细胞白血病的作用,可能与激活AMPK/m tOR信号通路有关。

关键词：急性t细胞淋巴细胞白血病 AMPK/mtOR信号通路白藜芦醇自噬

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质子海绵量子点-siRNA靶向Notch1蛋白治疗白血病的研究

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免疫学杂志 2013年第6期29卷 474-479页

作者：杨艳萍李薇林海杜忠华王冠军吉林大学白求恩第一医院肿瘤中心长春130021

目的研究质子海绵量子点-siRNA靶向急性t淋巴细胞白血病细胞系过度表达的Notch1蛋白的治疗效果。方法以Notch1过度表达的急性淋巴细胞白血病细胞系为研究背景,合成靶向Notch1基因的质子海绵包封的量子点(quantum dots,QD)-siRNA复合物... 详细信息

目的研究质子海绵量子点-siRNA靶向急性t淋巴细胞白血病细胞系过度表达的Notch1蛋白的治疗效果。方法以Notch1过度表达的急性淋巴细胞白血病细胞系为研究背景,合成靶向Notch1基因的质子海绵包封的量子点(quantum dots,QD)-siRNA复合物转染白血病细胞,与传统转染试剂Lipofectamine2000、transIt和JetPEI相比较,用免疫印迹方法、Rt-PCR方法检测转染效率,用CCK8分析法检测细胞毒作用。结果与其它转染试剂比较,质子海绵包封的QD-siRNA在基因沉默效应上取得了4～10倍的提高,同时mRNA的表达明显减少(P细胞毒性下降到其它转染试剂的47.6%～66.7%,存活细胞数量上升了1.5～2.1倍。结论质子海绵QD-siRNA应用到Notch1急性t淋巴细胞白血病细胞系中,与传统转染试剂比较,可提高基因沉默效应并降低细胞毒作用。

关键词：质子海绵量子点急性t细胞淋巴细胞白血病小分子干扰核糖核酸分子靶向治疗

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儿童B-ALL与t-ALL血清比较蛋白质组学分析

儿童B-ALL与T-ALL血清比较蛋白质组学分析

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作者：张靖宇郑州大学

学位级别：硕士

目的应用同位素标记的相对和绝对定量(isobaric tag for relative and absolute quantification,i tRAQ)标记的二维液相色谱串联质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2DLC-MS/MS)联合生物信息分析软件(Ingenuity Pathways Analysis,IPA)比较儿童急性t淋巴细胞白血病(t-cell acute lymphoblastic leukemia,t-ALL)与急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)血清差异表达蛋白,筛选ALL分型诊断标记物、t-ALL治疗的新靶点及探讨t-ALL可能的发病机制。方法1.收集儿童初治B-ALL与t-ALL血清各20例,分别等量混合每组血清标本,提取蛋白后应用多重亲和去除系统(Multiple Affinity Removel System,MARS)去除血清中14种高丰度蛋白,超滤除盐后采用Bradford法测定总蛋白浓度,并进行SDS-PAGE电泳,检测蛋白样品的质量。2.应用i tRAQ试剂标记经胰酶消化后的肽段,114标记B-ALL组,115标记t-ALL组。将标记后的肽段混合,运用二维高效反相液相色谱进行分离,然后串联质谱对样品进行分析鉴定。3.根据所鉴定出蛋白质的itRAQ相对定量值,通过对t-ALL组与B-ALL组的蛋白表达量进行比较,与B-ALL相比较,筛选出t-ALL中上调或下调1.2倍以上的差异蛋白。4.应用生物信息学软件IPA分析t-ALL与B-ALL相比较的差异表达蛋白,获得差异表达蛋白的生物功能以及参与的信号通路和蛋白相互作用网络;并根据IPA分析结果初步筛选出有意义的血清差异表达蛋白并探讨其意义。5.采用ELISA双抗夹心法分别检测了30例B-ALL、30例t-ALL的血清可溶性L-选择素(s L-selectin)表达水平,并计算其统计学意义来验证质谱的准确性。结果1.采用i tRAQ标记结合2DLC-MS/MS技术对t-ALL与B-ALL进行比较蛋白质组学研究,筛查t-ALL与B-ALL的血清差异蛋白。质谱共鉴定出有定量信息的非冗余蛋白468个,与B-ALL相比,计算t-ALL组蛋白表达值与B-ALL组比值,设定其比值>1.2或1.2且Pt-ALL组血清差异蛋白共有38个,其中显著上调蛋白质31个,下调蛋白质7个。2.将在i tRAQ定量蛋白质组学分析中得到的差异显著的蛋白质上传http://***进行IPA软件在线分析,经分析显示这些血清差异蛋白主要分布在与心血管疾病(Cardiovascular Disease)、脂质代谢(Lipid Metabolism)、分子转运(Molecular transport)、小分子生物化学(Small Molecular Biochemistry)、蛋白合成(Protein Synthesis)、细胞运动(Cellular Movement)、血液系统的发育和功能(Hematological System Development and Function)、免疫细胞运输(Immune Cell trafficking)、炎症反应(Inflammatory Response)等相关的功能中;3.血清差异蛋白参与的富集度较高的生物通路涉及肝X受体/类视黄醇X受体激活(LXR/RXR Activation)、动脉粥样硬化信号(Atherosclerosis Signaling)、巨噬细胞中白介素12信号与产生(IL-12 Signaling and Production in Macrophages)、巨噬细胞中一氧化氮和活性氧的产生(Production of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in Macrophages)、网格蛋白介导的内吞信号(Clathrin-mediated Endocytosis Signaling)、急性期反应信号(Acute Phase Response Signaling)、法尼醇X受体/类视黄醇X受体激活(FXR/RXR Activation)、补体系统(Complement System)等通路。4.差异蛋白共参与3个主要的蛋白相互作用网络(参与网络的目的蛋白超过8个),其中Lipid Metabolism/Molecular transport/Small Molecular Biochemistry网

关键词：急性t细胞淋巴细胞白血病急性B细胞淋巴细胞白血病儿童蛋白质组血清同位素标记的相对和绝对定量 IPA

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t-ALL免疫学、细胞遗传学、临床预后和Notch1基因突变的研究

T-ALL免疫学、细胞遗传学、临床预后和Notch1基因突变的研究

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作者：徐执政苏州大学

学位级别：硕士

目的探讨t-ALL中免疫表型、细胞遗传学的特点和与临床预后的关系及Notchl基因突变的情况方法①回顾性分析我院2000年初～2008年4月148例初治t-ALL患者形态学、免疫学分型和细胞遗传学资料,研究t-ALL患者免疫表型及细胞遗传学特点,并对... 详细信息

目的探讨t-ALL中免疫表型、细胞遗传学的特点和与临床预后的关系及Notchl基因突变的情况方法①回顾性分析我院2000年初～2008年4月148例初治t-ALL患者形态学、免疫学分型和细胞遗传学资料,研究t-ALL患者免疫表型及细胞遗传学特点,并对其中63例临床资料完整的住院t-ALL患者进行预后分析,研究伴髓系抗原(My)表达、CD34阳性及染色体异常对完全缓解率(CR)和预后的影响。②应用聚合酶链反应(PCR)及DNA直接测序方法研究31例t-ALL中Notchl基因突变的情况。结果①白血病细胞表面t系抗原表达依次为CD7＞CD2＞CD3。近20%患者CD10为阳性,148例患者中3例带有B系抗原CD19和或CD20,阳性率2.0%;52例带有髓系My标记,阳性率达35.1%,CD13表达高于CD33,1例存在CD14表达。CD34表达阳性率43.2%,64例CD34-t-ALL中髓系抗原表达者40例,阳性率62.5%,84例CD34-t-ALL中髓系抗原表达者12例,阳性率14.2%,二者具有统计学差异(P＜0.01)。②124例t-ALL患者核型分析成功,其中核型正常者74(59.7%)例,核型异常者50(40.3%)例。t-ALL异常核型检出率及复现率比较低,本组中出现2次或以上的结构性异常有:5q-、6q-、9p-、9q-、12p-、13q-、i(7q)、t(10;11)(p13;q23)、t(11;14)(p13;q11)和t(9;22)(q34;q11)共10种。异常核型中亚二倍体及超二倍体发生率不高,＞50条染色体的超二倍体更是远低于B-ALL。③63例住院t-ALL中18例(29%)伴有髓系抗原表达,其CR率明显低于髓系抗原阴性的病例(47%vs 89%,p=0.001),但二者中数生存期(MS)差异无统计学意义(19个月vs 26个月,p＞0.05)。63例住院t-ALL中CD34-t-ALL在早期CR率(52.6%vs 88.8%,p=0.003)及中数生存期(16个月vs 26个月)方面远低于CD34-t-ALL,二者间存在显著统计学差异(P＜0.05)。63例住院t-ALL中55例染色体分析获得成功,27(49.1%)例有核型异常,该组病例的早期诱导CR率(58.3%vs 91.6%,p=0.008)及中数生存期(15个月vs 26个月,P＜0.05)显著低于核型正常组。④31例t-ALL患者中有12例存在Notchl基因突变,占38.7%。对1例随访患者突变检测研究发现,初发时存在的点突变在CR时消失,说明突变来自白血病恶性克隆。B-ALL及其他对照样本均不存在Notchl突变。结论免疫表型分析是诊断t-ALL的重要手段,t—ALL免疫表型具有异质性,CD34表达与不良预后有关。t-ALL染色体异常核型类型和频率与B-ALL明显不同,表明t-ALL与B-ALL是生物学上不同的肿瘤。不同的核型改变预后不同,核型正常的t-ALL预后较好。t-ALL中Notchl基因突变发生率较高,Notchl基因突变在t-ALL发生中扮演着重要的作用。

关键词：急性t细胞淋巴细胞白血病免疫分型细胞遗传学预后 Notch1 基因突变

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