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急性病毒性坏死病毒魁蚶株IAP-86基因全长cDNA克隆和生物信息学分析

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渔业科学进展 2015年第1期36卷 85-90页

作者：张帅王崇明岳志芹宋晓玲白昌明尹伟力黄倢农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心青岛266002

为深入探讨急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrosis Virus,AVNV)魁蚶株的致病机理以及IAP-86蛋白的功能,从感染AVNV的濒死魁蚶外套膜中提取总RNA,反转录获得c DNA。根据NCBI公布的AVNV全基因组序列中ORF86序列设计两对反向套式引物,通... 详细信息

为深入探讨急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrosis Virus,AVNV)魁蚶株的致病机理以及IAP-86蛋白的功能,从感染AVNV的濒死魁蚶外套膜中提取总RNA,反转录获得c DNA。根据NCBI公布的AVNV全基因组序列中ORF86序列设计两对反向套式引物,通过c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得ORF86 5?端和3?端的非编码区,拼接获得全长c DNA序列。Blast序列比对显示,该基因与牡蛎疱疹病毒的同源性为100%,与栉孔扇贝AVNV的同源性为99%,并存在重叠基因。生物信息学分析预测,该蛋白不含信号肽,不存在跨膜区,最大疏水指数为1.800,最小疏水指数为–3.456。该蛋白存在8个潜在的磷酸化位点(包括5个丝氨酸、1个苏氨酸和2个酪氨酸),存在1个潜在的O-糖基化位点,不存在潜在的N-糖基化位点;其抗原表位主要集中在8-11、14-16、28-39、75-76、88-95、97-100和147-158位氨基酸。推测该株病毒可能为牡蛎疱疹病毒的变异株,并且基因重叠在该类病毒进化过程中可能扮演重要角色。

关键词：急性病毒性坏死病毒魁蚶细胞凋亡抑制蛋白 c DNA末端快速扩增技术生物信息学

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急性病毒性坏死病毒IAP-86基因的克隆、表达及抗凋亡研究

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水产学报 2014年第2期38卷 274-281页

作者：张帅王崇明宋晓玲白昌明黄倢中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒... 详细信息

在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86,将重组质粒转化到*** BL21(DE3)中,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40 ku,经Western-blotting和质谱分析证明,该蛋白即为IAP-86融合蛋白,Co2+柱纯化后得到了纯化的IAP-86融合蛋白。将重组的IAP-86蛋白用FITC标记,荧光显微镜下观察,发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合。细胞凋亡检测实验发现,重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡,凋亡抑制率为7%。本实验应用原核表达成功得到了IAP-86蛋白,并证明IAP-86对栉孔扇贝细胞的凋亡有一定抑制作用,这为进一步研究AVNV的侵染机制提供依据。

关键词：栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒杆状病毒凋亡抑制蛋白原核表达抗凋亡

急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆及表达分析

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急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆及表达分析

作者：贾志磊中国海洋大学

学位级别：硕士

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方沿海重要的养殖经济贝类之一，但自1997年起连续暴发的“大规模死亡症”导致了该产业的巨大损失。近年的研究证实，急性病毒性坏死病毒(Acute virus necrosis virus, AVNV)是其主要的致病病原。该... 详细信息

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方沿海重要的养殖经济贝类之一，但自1997年起连续暴发的“大规模死亡症”导致了该产业的巨大损失。近年的研究证实，急性病毒性坏死病毒(Acute virus necrosis virus, AVNV)是其主要的致病病原。该病毒为双链DNA病毒，病毒颗粒为具囊膜的二十面体结构，直径大小为130～170nm。2009年,任伟成等完成了AVNV病毒的全基因组测序分析，预测AVNV基因组中含有123个潜在的开放阅读框(open reading frames，ORF)，其中44个ORF具有一定的结构和功能，推测可能与病毒DNA复制、核酸代谢、修饰以及病毒与宿主相互作用等有关。而ORF074推测为编码脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase, dUTPase)的基因，主要与病毒DNA复制有关(任伟成等，2009)。脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase, dUTPase)是一种生物界普遍存在的重要水解酶，它与DNA复制和病毒毒力密切相关。为确定ORF074是否编码特定的具有功能的酶或蛋白，以及编码蛋白在AVNV感染、复制及AVND暴发中的作用，作者根据栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒ORF074基因序列，构建了dUTPase基因的原核表达载体，在***中进行原核表达、纯化并对重组dUTPase的酶学活性进行了分析;构建了dUTPase基因的真核表达载体pEGFP-N1-dut并在草鱼肾脏细胞(CIK)中进行了真核表达及亚细胞定位分析。此外，对AVNV病毒感染栉孔扇贝不同时间的基因表达进行荧光定量PCR分析，在mRNA水平进行转录和表达时序分析，探讨了基因对病毒在宿主体内复制的影响。另外，为构建AVNV的体外扩增系统，为更深入研究其侵染机制和致病机理提供技术平台，取健康栉孔扇贝的外套膜、血淋巴、鳃、闭壳肌、肾脏等组织进行体外的原代和传代培养，初步研究并建立了栉孔扇贝组织细胞的体外培养技术，为之后的研究提供了有益的探索。 *** dUTPase基因的克隆及原核重组表达。根据AVNV基因组序列，设计特异性引物，扩增编码AVNV dUTPase的ORF074,经1%琼脂糖凝胶电泳得到一条约750bp大小的条带，双酶切后将其连接至pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-dut，并将其转化至感受态细胞BL21(DE3)中，加IPTG至终浓度1mmol/L,诱导4-5小时后，SDS-PAGE电泳,得到一条约45kD的条带，经Western-blot及质谱分析确定为重组dUTPase。 2.重组dUTPase的纯化及酶学活性分析。利用Co亲和层析柱对表达的重组dUTPase进行了纯化并测定了纯化的重组dUTPase的比活、底物特异性、不同金属离子及EDTA对其活性的影响等。结果显示：1、重组dUTPase具有较强的底物特异性，能特异的催化dUTP水解。2、Mg、Ca、Co、Zn等金属离子能增强重组dUTPase的催化活性，其中Mg作用效果最显著，依次为Mg> Ca>Co> Zn。3、EDTA能抑制重组dUTPase的活性，而Mg、Ca、Co、Zn等金属离子能在一定程度上解除这种抑制作用。 3.利用荧光定量PCR技术完成了AVNV病毒感染栉孔扇贝后，dUTPase基因的转录时序分析。分别取感染AVNV病毒0,4,8,12,16,24,36,48h后栉孔扇贝的肝胰腺，提取总RNA，反转录，荧光定量PCR，确定了dUTPase基因在不同时间的表达。结果表明：该基因是一种早期基因，在AVNV感染栉孔扇贝4h后即开始表达，16h后达到峰值，之后逐步下降。 4.利用RACE技术确定了dUTPase基因的转录起始位点。利用5’RACE技术确定了dUTPase基因的转录起始位点。首先用AVNV病毒感染栉孔扇贝，16h后提取肝胰腺的总RNA，随机引物反转录，用末端转移酶加poly(C)尾巴，之后用根据dUTPase基因设计的GSP引物及Adaptor(dG)进行PCR扩增，得到一条约250bp的条带，经测序发现其转录起始位点为起始密码子上游第十个核苷酸——胸腺嘧啶脱氧核苷酸。 5.构建了重组真核表达载体pEGFP-N1-dut，并将其转染进草鱼肾脏细胞(CIK)中进行了真核表达及亚细胞定位分析。根据dUTPase基因的序列，设计真核表达用的特异性引物，双酶切后将其连接至真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组真核表达载体pEGFP-N1-dut，将重组载体转染至草鱼肾脏细胞(CIK)中，48h后，激光共聚焦显微镜观察其在CIK中的表达。表明重组质粒在CIK细胞的细胞质和细胞核中均有表达。 6.培养得到了栉孔扇贝鳃、肾脏、闭壳肌、外套膜、血淋巴等5种组织的细胞，并进行了传代

关键词： dUTP焦磷酸酶栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒原核表达酶学活性真核表达组织培养

急性病毒性坏死病毒两种功能基因的克隆、表达及功能分析

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急性病毒性坏死病毒两种功能基因的克隆、表达及功能分析

作者：张帅上海海洋大学

学位级别：硕士

急性病毒性坏死病毒（acute viral necrosis virus, AVNV）是20世纪末导致我国北方沿海栉孔扇贝大规模死亡的的重要致病病原。随着AVNV的全基因组序列的测定完成，确定该病毒全基因组序列一共包含123个可能的开放型阅读框(open reading ... 详细信息

急性病毒性坏死病毒（acute viral necrosis virus, AVNV）是20世纪末导致我国北方沿海栉孔扇贝大规模死亡的的重要致病病原。随着AVNV的全基因组序列的测定完成，确定该病毒全基因组序列一共包含123个可能的开放型阅读框(open reading frames, ORF)，其中的44个开放型阅读框具有一定的结构和功能。本论文通过基因克隆、原核表达、真核表达以及体外功能分析等技术研究其中两种功能基因的功能，这对了解AVNV的侵染机制和致病机理，从而为AVNV的防控提供有效理论依据。研究内容和结果如下：第一部分：通过基因克隆技术得到了AVNV ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因（IAP-86），将IAP-86基因与pET32a（+）质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86，之后将重组质粒转化到*** BL21（DE3）中，使用终浓度0.1%的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行蛋白诱导表达，SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40ku，经Western-blotting和质谱分析证明该蛋白即为IAP-86融合蛋白，Co2+柱纯化后得到了纯化的的IAP-86融合蛋白。第二部分：对原核表达得到的IAP-86蛋白进行功能性分析，首先将重组的IAP-86蛋白用FITC标记，荧光显微镜下观察，发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合，提示重组的IAP-86蛋白能够进入到细胞内发挥作用。使用细胞凋亡检测试剂盒针对IAP-86的抗凋亡作用进行分析，实验结果证实重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡，凋亡抑制率在7%左右。第三部分：为深入探讨魁蚶中检测到的急性病毒性坏死病毒（acute viralnecrosis virus, AVNV）魁蚶株的致病机理以及进一步研究IAP-86蛋白的功能，本实验从感染AVNV的濒死魁蚶外套膜中提取总RNA，反转录获得cDNA。根据NCBI公布的AVNV全基因组序列中ORF86序列设计两对反向套式引物，通过cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得ORF865’端和3’端的非编码区，拼接获得全长cDNA序列。Blast序列比对显示，该基因与牡蛎疱疹病毒的相似性为100%，与栉孔扇贝AVNV的相似性为99%，并存在重叠基因。生物信息学分析预测该蛋白不含有信号肽，不存在跨膜区，最大疏水指数为1.800，最小疏水指数为-3.456。存在8个潜在的磷酸化位点（包括5个丝氨酸、1个苏氨酸和2个酪氨酸），存在1个潜在的O-糖基化位点，不存在潜在的N-糖基化位点;其抗原表位主要集中在8-11、14-16、28-39、75-76、88-95、97-100和147-158位氨基酸。第四部分：在使用原核表达技术对AVNV解旋酶进行表达未获得成功的前提下，尝试使用酵母表达系统对AVNV解旋酶进行真核表达，本部分通过基因克隆技术获得了表达AVNV解旋酶的开放阅读框-ORF66，并将该基因连接到pPIC9K表达载体上，构建获得了真核表达载体pPIC9K-ORF66。

关键词：栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒 IAP-86 原核表达抗凋亡 cDNA末端快速扩增技术 SF2helicase 真核表达

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒巢式PCR检测方法的建立

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水产学报 2013年第2期37卷 281-287页

作者：李晨王崇明曲朋黄倢中国水产科学研究院黄海水产研究所中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室

为更好地实现对养殖海区栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)的快速诊断和分子流行病学的调查,以及AVNV的疫情监测,选择AVNV全基因组序列中的保守区段,应用Accelrys gene 2.5软件设计一对巢式引物,用于AVNV的... 详细信息

为更好地实现对养殖海区栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)的快速诊断和分子流行病学的调查,以及AVNV的疫情监测,选择AVNV全基因组序列中的保守区段,应用Accelrys gene 2.5软件设计一对巢式引物,用于AVNV的检测。结果显示,引物的扩增片段分别为979和548 bp。实验优化了PCR体系中Mg2+和dNTPs浓度及扩增程序中的退火温度,并建立了完善的AVNV巢式PCR检测技术。研究表明,该PCR检测技术具有较高的敏感性,可稳定检测出5 pg扇贝样品组织总核酸中5×10 copies的病毒粒子。

关键词：栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒巢式PCR

应用急性病毒性坏死病毒（AVNV）分子检测技术对其主要宿主的检测与分析

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应用急性病毒性坏死病毒（AVNV）分子检测技术对其主要宿主的检测...

作者：蔡玉勇中国海洋大学

学位级别：硕士

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方沿海养殖的主要贝类品种之一。“急性病毒性坏死病毒”(Acute Viral Necrosis Virus;AVNV)已被证实为是一种对养殖栉孔扇贝危害极大的病原体。本文应用已建立的AVNV核酸检测方法,对养殖扇贝、养殖... 详细信息

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方沿海养殖的主要贝类品种之一。“急性病毒性坏死病毒”(Acute Viral Necrosis Virus;AVNV)已被证实为是一种对养殖栉孔扇贝危害极大的病原体。本文应用已建立的AVNV核酸检测方法,对养殖扇贝、养殖海区浮游生物、养殖笼附着污损生物以及全国9省21个海区采集到的养殖贝类样品进行检测与分析,以探讨AVNV的主要宿主分布以及可能的传播途径。本文应用AVNV环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)对两个不同栉孔扇贝养殖海区的扇贝进行连续周年检测,研究AVNV在扇贝体内的感染增殖规律以及探讨综合生态调控技术对扇贝流行病控制效果。检测结果表明,08、09两年青岛流清河养殖海区扇贝样品在夏季大规模死亡季节均能检测到较高的AVNV携带率,其中08年5月-09年4月野生苗种扇贝8月份阳性率最高,达到75%,全年平均携带率为35%;09年1月-12月三种扇贝苗种蓬莱红、人工育苗和野生苗,7月份AVNV携带率最高分别为20%、70%和80%,扇贝携带AVNV的阳性率与扇贝大规模死亡流行病学的特征具有正相关性,而高温(7月和8月份海温度水平均23℃以上)可能是导致AVNV感染扇贝死亡的重要环境胁迫因子;桑沟湾扇贝养殖海区属于贝藻混养海区,由于部分苗种来源问题,桑沟湾检测到AVNV携带率最高时间为4月份扇贝分苗挂养时,蓬莱红、人工育苗和野生苗AVNV携带率分别为50%、60%和0,野生苗5月、6月AVNV携带率最高均为30%。09年流清河扇贝养殖场蓬莱红、人工育苗、野生苗存活率分别为39.1%、40.7%、45.3%;桑沟湾扇贝养殖场蓬莱红、人工育苗、野生苗存活率分别为96.8%、89.2%、90%,表明贝藻混养的养殖模式较单一养殖模式能利用大型藻类对扇贝养殖环境的生态调控,可以显著地降低病原水平,降低扇贝发病率。对09年对青岛流清河与荣成桑沟湾两个不同的扇贝养殖海区浮游生物采样调查,研究浮游生物是否能携带AVNV及其变化情况。利用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)技术对不同粒径的浮游生物携带AVNV进行定量检测,结果表明两个扇贝养殖海区均检测到AVNV阳性样品存在,而且不同粒径的浮游生物携带AVNV量有差异,粒径小于200目的浮游生物携带AVNV的量最大,达到9.45×106拷贝/mg总DNA,粒径60目—200目的之间浮游生物次之,粒径大于60目的浮游生物携带量最少,仅为5.81×104拷贝/mg总DNA。在上述两个扇贝养殖海区,均在8月份检测到浮游生物携带AVNV,与栉孔扇贝夏季大规模死亡现象在时间上吻合。实验结果表明：浮游生物可以携带AVNV,可能在AVNV的流行和传播中起到传播媒介的作用。对09年两个不同的扇贝养殖海区养殖扇贝扇贝笼上经常出现的几种附着污损生物检测其能否携带AVNV,是否是AVNV的潜在宿主,探讨附着污损生物在AVNV传播过程中起到有什么作用。两个海区中长牡蛎、紫贻贝、柄海鞘和麦秆虫样品中均检测到AVNV阳性的存在,青岛流清河扇贝养殖海区的东方缝栖蛤未检测到AVNV阳性样品存在,表明长牡蛎、紫贻贝、柄海鞘和麦秆虫可以携带AVNV,是AVNV的宿主,东方缝栖蛤未检测到AVNV,可能不是AVNV的宿主。自06年11月至09年11月从中国沿海9个省21个海区共采集38批586份样品,包括20种主要养殖贝类,其中双壳纲贝类16种,腹足纲4种。检测这些贝类样品携带AVNV的携带情况,除栉孔扇贝以外有8种贝类样品可以携带AVNV,说明AVNV在养殖贝类中有较广泛的宿主范围,包括：虾夷扇贝、华贵栉孔扇贝、杂色蛤、紫贻贝、翡翠贻贝、长牡蛎、近江牡蛎和方斑东风螺等;共有11种贝类样品未检测到AVNV阳性样品存在,这些样品包括海湾扇贝、波纹巴非蛤、文蛤、泥蚶、黄边糙鸟蛤企鹅珍珠贝、马氏珠母贝、黑碟贝、皱纹盘鲍、黑鲍和泥螺,但是受到采样地点、时间和样品数量的限制,这些样品能否携带AVNV还有待于进一步研究。

关键词：栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒宿主范围浮游生物附着生物

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒基因组全序列的测定与分析

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栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒基因组全序列的测定与分析

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒cDNA文库的构建及部分序列分析

中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学会分会第十四次学会研讨会

作者：任伟成蔡玉勇王崇明中国水产科学研究院黄海水产研究所

急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrosis Virus,AVNV),是引起栉孔扇贝(Chlamys farreri)夏季大规模死亡的直接病原。该病毒的形态学、病理学和流行病学等方面的特征与感染牡蛎等双壳贝类的牡蛎疱疹病毒(Ostreid Herpesvirus 1,OsHV-1... 详细信息

急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrosis Virus,AVNV),是引起栉孔扇贝(Chlamys farreri)夏季大规模死亡的直接病原。该病毒的形态学、病理学和流行病学等方面的特征与感染牡蛎等双壳贝类的牡蛎疱疹病毒(Ostreid Herpesvirus 1,OsHV-1)相似。

关键词：栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒疱疹病毒基因组全序列

来源： cnki会议评论

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中国水产科学 2006年第3期13卷 421-425页

作者：王崇明艾海新刘英杰王秀华李赟中国水产科学研究院黄海水产研究所中国水产科学研究院中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室

急性病毒性坏死症病毒(Acute Virus Necrobiotic Virus,AVNV)已被证实是一种对养殖栉孔扇贝(Chlamys farreri)危害极大的致病病原。本研究应用基因克隆技术对AVNV基因组进行cDNA合成、克隆,并对部分克隆进行序列分析。采用差速和蔗糖密... 详细信息

急性病毒性坏死症病毒(Acute Virus Necrobiotic Virus,AVNV)已被证实是一种对养殖栉孔扇贝(Chlamys farreri)危害极大的致病病原。本研究应用基因克隆技术对AVNV基因组进行cDNA合成、克隆,并对部分克隆进行序列分析。采用差速和蔗糖密度梯度离心法,分离纯化AVNV。用Trizol试剂抽提病毒RNA,采用随机引物和Oligo(dT)双引物法,SuperScriptⅡ反转录酶合成cDNA,并克隆于pUC118质粒上,利用蓝白斑筛选阳性克隆子,PCR法快速鉴定重组质粒。经筛选得到2个阳性克隆23#、52#,插入片段大小约为1 200 bp和800 bp。测序结果与GenBank的比对分析显示,尚未有类似的序列报道,提示该病毒可能为一种新发现的病毒。

关键词：栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒 cDNA文库克隆序列分析

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒cDNA文库的构建及部分序列分析

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栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒cDNA文库的构建及部分序列分析