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中华微生物学和免疫学杂志 2020年第5期40卷 350-354页

作者：姜德水杨茜焦红波张步芳潘衍宇曹丽娇张宇涵胡彬胡军熊衍文山东省兰陵县疾病预防控制中心临沂277700 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206 山东省疾病预防控制中心济南250014

目的了解山东省兰陵县羊携带志贺毒素基因stx2k新亚型大肠埃希菌的情况及其分子特征。方法2019年11月采集山东省兰陵县不同养殖户的羊粪便512份,经EC肉汤增菌后PCR检测stx基因,阳性样品分别接种科玛嘉(CHROMagar^TM)ECC及科玛嘉(CHROMag... 详细信息

目的了解山东省兰陵县羊携带志贺毒素基因stx2k新亚型大肠埃希菌的情况及其分子特征。方法2019年11月采集山东省兰陵县不同养殖户的羊粪便512份,经EC肉汤增菌后PCR检测stx基因,阳性样品分别接种科玛嘉(CHROMagar^TM)ECC及科玛嘉(CHROMagar^TM)STEC培养基,对stx基因阳性菌株进行全基因组测序。根据基因组数据分析菌株stx基因亚型、血清型、多位点序列分型(MLST)情况及毒力基因携带情况。结果从512份羊粪中共分离86株产志贺毒素大肠埃希菌,包括5种不同的stx亚型,其中stx2k亚型菌株37株;86株菌分为20种O∶H血清型及18种不同ST型。结论山东省兰陵县羊携带的产志贺毒素大肠埃希菌在志贺毒素亚型、血清型及毒力基因等分子特征方面存在多样性,且检出了产志贺毒素2k新亚型的大肠埃希菌。

关键词：产志贺毒素大肠埃希菌志贺毒素2k 全基因组测序

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产志贺毒素2k新亚型大肠埃希菌的鉴定及其分子特征分析

产志贺毒素2k新亚型大肠埃希菌的鉴定及其分子特征分析

引用

作者：杨茜中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）是一类重要的食源性致病菌,人感染后可引起轻度腹泻、出血性肠炎（hemorrhagic colitis,HC）甚至病死率高的溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome,HUS）... 详细信息

产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）是一类重要的食源性致病菌,人感染后可引起轻度腹泻、出血性肠炎（hemorrhagic colitis,HC）甚至病死率高的溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome,HUS）。牛羊等反刍动物是STEC主要宿主,人主要经粪-口途径感染。目前已报道的STEC血清型达470多种,其中O157:H7是致病性最强也是最常见的血清型,但近年来由非O157 STEC引起的散发感染和暴发的报道越来越多,由其引发的病例在某些国家超过了 STEC O157:H7。志贺毒素（Shiga toxin,Stx）是STEC最重要的毒力因子,可分为志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）和志贺毒素2（Shiga toxin 2,Stx2）两种型别。迄今为止已报道STEC中存在3种Stx1亚型和9种Stx2亚型,不同亚型或亚型组合在宿主特异性及致病性等方面存在差异。目前对Stx1/Stx2亚型的鉴定主要通过基于stx1/stx2基因序列差异建立的亚型特异性PCR方法。我们前期对STEC菌株进行亚型分析时,发现1株stx2阳性菌株STEC388不能用现有PCR方法进行分型。将其与目前已知的不同Stx2亚型的氨基酸代表序列构建系统发生树,结果显示STEC388为一个单独分支,即此菌株携带一种新的Stx2亚型,将其命名为Stx2k。Stx2k与Stx2a-Stx2i的核苷酸序列相似性为62.5%～96.3%,氨基酸序列相似性为72.7%～97.0%。根据stx2k基因特定差异位点,设计了 Stx2k的PCR分型检测引物,对实验室自2009年4月到2017年11月间收集和分离的787株非O157 STEC进行了 Stx2k筛查,发现了另外8株Stx2k-STEC菌株,对这些菌株进行分子特征分析。9株Stx2k-STEC菌株经丝裂霉素C诱导后,对Vero细胞的毒性存在较大差异,但总体上均低于STEC O157:H7暴发菌株Xuzhou21。全基因组测序显示9株STEC菌株基因组大小为4,857,389 bp～5,326,462 bp,可分为 7 种血清型（O8:H19、O48:H21、O100:H19、O159:H16、ONT:H30、022:H8 和 O93:H28）,7 种 MLST 型 ST162、ST155、ST1611、ST3630、ST993、ST446和ST403)。Stx由前噬菌体编码,Stx2k前噬菌体存在4种不同的染色体插入位点:dus、yccA、zur及Ser-tRNA。全基因进化分析显示,Stx2k-STEC菌株与STEC、ETEC及STEC/ETEC杂合型菌株具有较近亲缘关系,提示Stx2k噬菌体具有整合到不同遗传背景大肠埃希菌中的能力。仅志贺毒素并不能引起严重疾病,位于LEE毒力岛上的eae基因（*** attaching and effacing）编码的紧密粘附素（intimin）也在STEC O157:H7的致病性中也发挥重要作用,而非O157 STEC携带eae基因的研究较少。本研究对eae在非O157 STEC菌株中的分布情况及序列多态性进行了分析。735株非O157 STEC菌株中共有70株（9.5%）eae基因阳性菌株,分别分离自不同动物（43株）、腹泻患者（9株）及食品（4株）,其余14株来源不详。通过PCR扩增测序得到了 62条eae基因全长序列,根据序列相似性分为18种不同的基因型,核苷酸序列相似性从86.01%到99.97%不等,其中7种基因型为本研究首次报道。通过对已报道的30种不同eae基因亚型参考序列与本研究获得的18条特异序列构建Neibour-Joining系统发生树,本研究的eae基因可分为5种亚型,即β1、γ1、ε1、ξ3和θ。研究发现eae亚型/基因型与血清型及菌株来源有一定相关性。血清型为O26:H11、O103:H2及O111:H8的菌株与特定的eae亚型相关,分别对应ε1、β1和θ。大部分腹泻患者来源的STEC（7/9,77.8%）携带 eae-β1 亚型,而大部分牛来源的 STEC（23/26,88.5%）携带 eae-ζ3亚型。综上所述,本研究发现和命名了一种新的Stx2k亚型,丰富了 Stx2亚型,进一步强调了 STEC菌株基因组的可塑性,并分析了中国不同来源的非O157 STEC菌株中eae基因的遗传多样性。

关键词：产志贺毒素大肠埃希菌志贺毒素2k 志贺毒素噬菌体紧密黏附素全基因组测序

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