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sDr5-Fc抑制中性粒细胞浸润及活化减轻心肌缺血—再灌注损伤

sDR5-Fc抑制中性粒细胞浸润及活化减轻心肌缺血—再灌注损伤

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作者：张振凯河南大学

学位级别：硕士

背景:为避免长时间缺血导致心肌受损加重,利用溶栓、经皮冠状动脉介入术、冠状动脉搭桥等方式,使缺血的心肌恢复血液灌注。但血液再灌注能够引起心肌损伤加重,这种现象称为心肌缺血-再灌注(ischemia/reperfusion,i/r)损伤。多重因素参... 详细信息

背景:为避免长时间缺血导致心肌受损加重,利用溶栓、经皮冠状动脉介入术、冠状动脉搭桥等方式,使缺血的心肌恢复血液灌注。但血液再灌注能够引起心肌损伤加重,这种现象称为心肌缺血-再灌注(ischemia/reperfusion,i/r)损伤。多重因素参与心肌i/r损伤,其中来自外周血中的中性粒细胞是导致心肌损伤加重的因素之一。中性粒细胞是心肌i/r损伤中的一种标志性细胞。当心肌发生i/r后,大量的中性粒细胞聚集在心肌损伤区域。一部分中性粒细胞在心肌毛细血管处聚集,堵塞毛细血管,使再灌注的心肌出现“无复流”现象;另一部分中性粒细胞趋化到受损的心肌组织,使心肌组织炎症反应加剧。我们先前的研究结果显示sDr5-Fc能够减轻心肌i/r损伤,但其保护作用的潜在机制并不完全清楚。中性粒细胞浸润及活化能够使心肌i/r损伤加重,因此我们猜想sDr5-Fc能否通过调控中性粒细胞发挥其对心肌组织的保护作用。目的:通过构建急性心肌i/r损伤动物模型以及H9c2细胞缺氧-复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/r)模型,验证sDr5-Fc能否通过抑制中性粒细胞浸润及活化减轻心肌i/r损伤。方法:为验证sDr5-Fc抑制中性粒细胞浸润到受损的心肌组织。我们通过结扎大鼠冠状动脉构建大鼠急性心肌梗死模型,利用小动物心电图仪检测急性心肌梗死模型是否构建成功,利用TTC染色检测大鼠心肌irh模型是否构建成功;通过Evans blue-TTC染色、ELiSA检测肌钙蛋白i(cTni)的含量,评估sDr5-Fc能否减轻大鼠心肌i/r损伤;通过MPO免疫组织化学染色检测心肌组织中中性粒细胞的含量,评估sDr5-Fc对中性粒细胞浸润的抑制作用;利用流式细胞术、MPO免疫组织化学染色检测中性粒细胞抗体(Anti-rat PMN)耗竭大鼠中性粒细胞的效果;通过TTC染色、HE染色、TUNEL,对比sDr5-Fc与Anti-rat PMN对心肌组织的保护作用。为验证sDr5-Fc对中性粒细胞活化的抑制作用,我们利用中性粒细胞分离液,分离大鼠外周血中性粒细胞;利用低氧工作站建立H9c2细胞Hrh模型;利用Hoechst、MTS检测sDr5-Fc是否通过抑制共培养体系中中性粒细胞的活化,减轻H9c2细胞损伤;利用qPCr、ELiSA验证sDr5-Fc阻断TrAiL诱导的中性粒细胞的活化。结果:大鼠冠状动脉结扎后,大鼠心电图S-T段明显抬高,大鼠急性心肌梗死模型构建成功;TTC染色显示:irh组大鼠心脏梗死区重量约占左心室重量的50%,大鼠心肌irh模型构建成功;Evans blue-TTC染色以及ELiSA结果显示:与PBS组相比sDr5-Fc组能够明显减少大鼠心肌梗死面积以及外周血cTni的含量;MPO免疫组织化学染色结果显示:sDr5-Fc能够抑制中性粒细胞对受损心肌组织的浸润;TTC染色、HE染色、TUNEL结果显示:sDr5-Fc能够抑制中性粒细胞浸润减轻大鼠心肌i/r损伤。以上结果说明:sDr5-Fc通过抑制中性粒细胞对受损心肌组织的浸润减轻大鼠心肌i/r损伤。在细胞实验中,血细胞计数仪、流式细胞术以及瑞氏-吉姆萨染色结果显示:分离得到的中性粒细胞的纯度占89%以上,中性粒细胞分离成功;MTS、LDH结果显示:心肌细胞在Hrh时,H9c2细胞活力降低,LDH释放增多,因此选择Hrh为H9c2细胞H/r的最佳时间点;Transwell实验显示:H9c2细胞在Hrh时有大量中性粒细胞从上室穿到下室,说明H/r后的H9c2细胞对中性粒细胞产生强烈的趋化作用;Hoechst结果显示:中性粒细胞能够增加H9c2细胞凋亡,sDr5-Fc能够抑制由中性粒细胞引起的H9c2细胞凋亡;MTS结果显示:sDr5-Fc能够减轻中性粒细胞对H9c2细胞造成的活力受损,说明sDr5-Fc能够通过抑制中性粒细胞活化发挥对H9c2细胞的保护作用;qPCr、ELiSA结果显示:sDr5-Fc能够阻断TrAiL诱导中性粒细胞表达TNF-α、iL-1β。以上结果说明sDr5-Fc可通过抑制中性粒细胞活化减轻共培养体系中H9c2细胞的损伤。结论:1、sDr5-Fc通过抑制外周血中性粒细胞的浸润减轻心肌i/r损伤。2、sDr5-Fc通过抑制中性粒细胞活化减轻共培养体系中H9c2细胞的损伤。

关键词： sDr5-Fc 中性粒细胞心肌i/r损伤 H9c2细胞

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