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糖尿病大鼠心肌损伤及发病机理的实验研究

糖尿病大鼠心肌损伤及发病机理的实验研究

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作者：卢泽芬河北医科大学

学位级别：硕士

目的:糖尿病(DM)是目前影响人类健康的常见疾病之一,糖尿病病人发生充血性心力衰竭的危险性显著增高,糖尿病心肌病(DCM)是危险性增高的主要原因。糖尿病心肌病通常表现为心肌舒张和(或)收缩功能障碍,而心肌细胞收缩和舒张与细胞内游离C... 详细信息

目的:糖尿病(DM)是目前影响人类健康的常见疾病之一,糖尿病病人发生充血性心力衰竭的危险性显著增高,糖尿病心肌病(DCM)是危险性增高的主要原因。糖尿病心肌病通常表现为心肌舒张和(或)收缩功能障碍,而心肌细胞收缩和舒张与细胞内游离Ca的浓度密切相关,其中起主要调控作用的是肌浆网Ca-ATPase(SERCA),目前研究的重点也集中于高血糖状况下心肌SERCA活性的变化对心肌收缩和舒张功能的影响,及影响SERCA活性的相关因素。目前研究显示:在糖尿病状态下,体内氧化应激增强,进而影响心肌SERCA功能,使心肌细胞内Ca浓度失调,引起糖尿病心肌病。本研究主要就此展开,共分为四部分: 1复制糖尿病大鼠模型:在标准条件下,应用一次性腹腔注射大剂量链脲佐菌素(STZ)的方法复制糖尿病大鼠模型,通过大鼠临床症状和监测静脉血糖确定模型复制成功。 2光镜下观察糖尿病大鼠心肌病理学改变:将福尔马林固定的心肌组织经过石蜡包埋、切片,经苏木素、伊红液染色,在光镜下观察、摄片。 3测定糖尿病大鼠心肌肌浆网Ca-ATPase(SERCA)活性、代表氧化应激损伤的中间产物丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)两种抗氧化酶类的活性。 4测定糖尿病大鼠心肌肌浆网Ca-ATPase(SERCA2α)mRNA的基因表达水平。方法:本研究在成功复制糖尿病动物模型的基础上,利用病理学实验技术、生物化学及分子生物学方法,系统观察了糖尿病大鼠心肌光镜下的病理学改变、心肌SERCA活性变化及其亚型SERCA2αmRNA基因表达水平、以及氧化应激相关产物和抗氧化酶类活性的变化。探讨糖尿病心肌病发病机制,为临床预防及治疗提供依据。本研究共分为四部分: 1糖尿病动物模型的复制:50只SD大鼠适应性喂养1周后,按体重随机分为正常对照组(N组)及糖尿病模型复制组(D组),N组20只,D组30只,将N组随机分为4周组(N4)、8周组(N8),D组分为4周组(D4)、8周组(D8)。禁食不禁水12小时,D组大鼠按60mg/kg STZ溶液一次性腹腔注射(临用前用0.1mol/L枸橼酸缓冲液溶解,PH4.5),N组腹腔注射等量上述的枸橼酸缓冲液。72h后尾静脉采血测定空腹血糖及定性尿糖,空腹血糖≥16.7mmol/L,尿糖定性≥+++,动物多饮、多食和尿量增加者确定为D组模型。饲养期间N组和D组均给予相同的饮食和水。每周测一次体重和血糖,测血糖前12小时禁食不禁水,所有动物均单笼饲养,自由进食及饮水,共观察8周,其间未用过胰岛素治疗,D组有 2只大鼠血糖未达到以上标准,4只大鼠在饲养过程中因感染、酮症等原因死亡,剔除出本试验。大鼠饲养至相应周数处死取材。 2心肌切片HE染色观察心肌光镜下的病理学改变:将福尔马林固定的心肌组织经过石蜡包埋、切片,经苏木素使胞核着色、伊红液使胞质着色,在光镜下观察、摄片。 3心肌SERCA活性及氧化应激中间产物、相关抗氧化酶水平的测定:分别取4周、8周糖尿病组大鼠及相应正常对照组大鼠的心肌组织,制备成10%的心肌组织匀浆,利用生物化学的方法测定组织匀浆中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平,将10%组织匀浆高速离心制备出心肌肌浆网,利用生物化学的方法测定SERCA活性。 4心肌SERCA2αmRNA基因表达水平的测定:取-80℃保存的新鲜左心室心肌组织100mg,利用Trizol一步法提取总RNA,再逆转成cDNA,应用RT-PCR的方法扩增目的基因SERCA2α,利用管家基因β-action作为内参照,1.2%琼脂糖凝胶电泳后,应用MIAS-5.0进行灰度测量,结果取目的基因与内参照的比值进行半定量分析。结果:1糖尿病组大鼠表现为多饮、多尿、体重较相应对照组降低,血糖≥16.7mmol/L,判断糖尿病大鼠模型复制成功。 2与正常对照组大鼠相比,4周糖尿病组大鼠心脏光镜下无明显病理学改变,8周组出现心肌细胞肿胀、核仁固缩、小动脉壁细胞核层数增多、核深染、部分小动脉玻璃样变。 3与正常对照组大鼠相比,D组SERCA活性明显下降(P心肌细胞肿胀、核仁固缩、小动脉壁细胞核层数增多、核深染、部分小动脉玻璃样变等心肌损伤的病理学改

关键词：糖尿病心肌病氧化应激心肌肌浆钙泵链脲佐菌素

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