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Foxa2调控P19胚胎癌细胞心肌分化过程的分子机制

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中南大学学报（医学版） 2013年第4期38卷 356-364页

作者：朱洪张震刘义陈燕谭拥军湖南大学生物学院生物医学工程系长沙410082

目的:研究转录因子forkhead box A2(Foxa2)在P19胚胎癌细胞心肌分化过程中的作用及其分子机制。方法:运用在P19细胞胚胎小体(embryoid bodies,EBs)培养基中加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)的方法将P19细胞诱导分化成心肌细胞,运... 详细信息

目的:研究转录因子forkhead box A2(Foxa2)在P19胚胎癌细胞心肌分化过程中的作用及其分子机制。方法:运用在P19细胞胚胎小体(embryoid bodies,EBs)培养基中加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)的方法将P19细胞诱导分化成心肌细胞,运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法检测诱导分化过程中不同时间点细胞样本中胚胎性干细胞多能性相关基因(Nanog)、心肌分化相关基因[Cerberus1(Cer1)和Sonic Hedgehog(Shh)]及Foxa2的mRNA水平,用免疫荧光染色的方法检测分化成熟的心肌细胞。同时分别运用转染真核表达质粒pCMV-rFoxa2(大鼠Foxa2)和构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)-rFoxa2 P19细胞株的方法以提高P19细胞中Foxa2的表达水平,采用RT-PCR和Western印迹的方法检测上述细胞样本中多能性相关基因和心肌分化相关基因的mRNA和蛋白水平,及其EBs分化体系中心肌分化相关基因的mRNA水平。结果:P19细胞经DMSO诱导后分化形成心肌细胞,并伴随有Foxa2的表达激活。转染pCMV-rFoxa2质粒能在P19细胞中瞬时高量表达rFoxa2并激活其下游Cer1的转录。运用稳定表达GFP-rFoxa2的P19细胞株增高Foxa2的表达可以抑制Nanog的表达,并激活Shh的表达,促进P19细胞EBs心肌分化,表达Cer1和心脏α肌动蛋白(actin,alpha cardiac muscle 1,Actc1)。结论:Foxa2参与P19细胞心肌分化过程,Foxa2在DMSO诱导P19细胞心肌分化过程中的作用机制可能为直接抑制Nanog的表达,并激活Cer1和Shh的表达。

关键词： Foxa2 P19细胞 DMSO 心肌分化

GSNO亚硝基化Drp1调控小鼠胚胎干细胞定向分化心肌细胞的研究

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GSNO亚硝基化Drp1调控小鼠胚胎干细胞定向分化心肌细胞的研究

作者：陈丽婷浙江大学

学位级别：硕士

研究背景胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）来源于植入前胚泡的内细胞团,能在体外无限增殖并且分化为所有类型细胞。ESCs衍生心肌细胞具有早期心肌细胞的结构与功能特点,与动物实验结合可以作为心脏疾病治疗药物药效和毒性评价... 详细信息

研究背景胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）来源于植入前胚泡的内细胞团,能在体外无限增殖并且分化为所有类型细胞。ESCs衍生心肌细胞具有早期心肌细胞的结构与功能特点,与动物实验结合可以作为心脏疾病治疗药物药效和毒性评价体系。S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione,GSNO）是抗氧化剂谷胱甘肽的S-亚硝基化衍生物,通过S-亚硝基化修饰靶蛋白诱导下游信号通路调控多种生物学过程,包括转录过程、DNA修复损伤、细胞分化及凋亡等。课题组前期发现GSNO短暂处理能显著诱导小鼠ESCs（mouse embryonic stem cells,mESCs）定向分化为心肌细胞,经蛋白组学分析有104个蛋白分子S-亚硝基化上调。根据细胞定位对这些蛋白进行分类,80%蛋白定位于细胞器,特别是线粒体和核糖体。我们进一步研究发现GSNO促心肌分化与线粒体缝隙连接蛋白43的C271位点发生S-亚硝基化修饰进而促进线粒体成熟有关。而线粒体在细胞内通过裂变和融合不断循环调节形成线粒体网,在调节干细胞增殖和启动分化的信号通路中起到了关键作用。线粒体动力学相关蛋白1（dynamin-related protein 1,Drp1）介导线粒体分裂,通过翻译后修饰包括磷酸化、泛素化和S-亚硝基化,共同影响Drp1活性以及在胞质和线粒体外膜之间的易位。其中Drp1的S-亚硝基化修饰可诱导其GTPase活性上调和蛋白质构象改变,促进线粒体分裂和融合。线粒体-内质网偶联结构（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane,MAMs）是细胞内线粒体分裂和融合以及钙离子运输的主要场所,在此发生的分子事件参与干细胞分化以及多能性维持。基于以上研究背景,GSNO是否通过亚硝基化Drp1影响线粒体动力学以及MAMs结构中钙离子流,从而促进mESCs定向分化心肌细胞尚未阐明。研究目的本研究主要探索GSNO是否通过亚硝基化Drp1,促进线粒体分裂融合,调节MAMs结构及钙离子浓度,从而揭示Drp1亚硝基化修饰在GSNO促mESCs定向分化心肌细胞中的作用。研究方法与结果利用mESCs体外心肌分化模型,在悬滴培养day 5时用25μM GSNO避光处理拟胚体（embryonic bodies,EBs）2 h,100 n M RA处理作为促心肌分化的阳性对照。在贴壁培养day 5+3时收集样本,Western blot法和免疫荧光染色结果表明GSNO组和RA组由EBs衍生细胞中心肌特异性蛋白α-actinin表达显著上调,形成了成熟的明暗相间的肌小节结构,比阴性对照组更致密有序。接着,我们研究了GSNO对EBs分化过程中线粒体的作用,采用Mito Tracker?Green FM探针染色和Western blot法,发现GSNO组部分线粒体被激活分裂,线粒体融合蛋白Mfn2和线粒体标志蛋白Tom20表达均显著上升,而Drp1总蛋白表达与阴性对照组相比没有差异。进一步采用Biotin-Switch法提取总蛋白中的S-亚硝基化修饰蛋白,发现GSNO处理后Drp1的S-亚硝基化修饰水平显著上调。采用线粒体分离试剂将胞质和线粒体分离后提取蛋白,发现GSNO处理后线粒体Drp1表达显著上升,胞质中Drp1表达明显下降。提示GSNO可以促进线粒体融合和分裂且增加线粒体生成,同时诱导Drp1发生S-亚硝基化修饰,促进Drp1向线粒体转移而调节线粒体分裂。接着,我们通过转染慢病毒方法,在mESCs中特异性过表达Drp1及其亚硝基位点突变体Drp1C650A。结果显示,在day 5的EBs中,与GSNO+Drp1组相比,GSNO+Drp1C650A组Drp1的S-亚硝基化修饰水平显著下调。与之对应地,通过流式细胞术检测发现day 5+3 EBs衍生细胞中GSNO+Drp1C650A组的α-actinin蛋白阳性细胞比例和荧光表达都显著下降,明暗相间的成熟肌小节减少。结果提示Drp1亚硝基化位点突变不利于GSNO诱导mESCs定向分化为心肌细胞。为了探讨GSNO是否通过Drp1的S-亚硝基化修饰影响线粒体动力学,我们用Mito Tracker?Green FM探针染色观察发现day 5 EBs中GSNO+Drp1C650A组与GSNO+Drp1组相比,线粒体分裂减少,细长管状线粒体增加。Western blot结果显示,GSNO+Drp1C650A组全细胞蛋白的p-Drp1（Ser616）、线粒体部分的Drp1及p-Drp1（Ser616）表达均显著下调,提示GSNO诱导Drp1亚硝基化可以促进线粒体融合与分裂,维持线粒体网络动态平衡。免疫荧光共染结果显示day 5 EBs经GSNO处理后Drp1和Tom20以及p-Drp1（Ser616）和Tom20的共定位均增加,而GSNO+Drp1C650A

关键词： S-亚硝基谷胱甘肽 Drp1 S-亚硝基化修饰胚胎干细胞心肌分化线粒体

心肌分化过程中经典Wnt信号促进Isl1表达

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中国生物化学与分子生物学报 2015年第8期31卷 827-835页

作者：李彦明鲁华菲李涛陈苹马康涛周春燕贾竹青河南大学淮河医院心内科河南开封475000 北京大学基础医学院生物化学与分子生物学系北京100191 浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004

ISL1是第二生心区的分子标志,在心血管发育中发挥重要作用.在心脏发育过程中,Isl1的表达具有鲜明的时空特异性.本研究利用P19CL6畸胎瘤干细胞作为心肌分化模型,探讨了Isl1在心肌诱导分化过程中的时间特异性表达及经典Wnt信号通路对其的... 详细信息

ISL1是第二生心区的分子标志,在心血管发育中发挥重要作用.在心脏发育过程中,Isl1的表达具有鲜明的时空特异性.本研究利用P19CL6畸胎瘤干细胞作为心肌分化模型,探讨了Isl1在心肌诱导分化过程中的时间特异性表达及经典Wnt信号通路对其的调控.研究发现,Isl1在心肌分化早期高表达,于诱导第4 d到达高峰,随后快速下调.其表达趋势与经典Wnt通路的激活模式具有时间上的同步性.通过加入Wnt3a蛋白及Li Cl激活经典Wnt通路,能够促进Isl1基因的表达,而Wnt通路抑制分子Frizzled-4/Fc和DKK1能够下调Isl1表达.β-catenin过表达及RNAi实验也获得相似的结果.染色质免疫共沉淀实验证实,Wnt通路效应分子LEF1,在细胞分化第4 d与其在Isl1基因启动子上游-2 300 bp处的结合增强,因而促进了Isl1基因的表达.本研究表明,经典Wnt信号能够通过LEF1/β-catenin与Isl1启动子特异结合,调控Isl1基因在心肌早期分化阶段的表达.

关键词：心肌分化 P19CL6细胞胰岛因子1 表达调控经典Wnt信号通路

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雷帕霉素诱导Mef2c表达促进心肌分化

河南大学学报（医学版） 2022年第1期41卷 35-40页

作者：程思雅王东兴李涛李彦明程冠昌翁晓菲汪萍萍河南大学临床医学院河南开封475000 湖南师范大学医学院长沙410013 河南大学淮河医院心内科河南开封475000

目的:评价小分子化合物雷帕霉素、羟氯喹和MC1568对心肌分化效率和心肌分化转录因子Mef2c表达的影响。方法:利用DMSO诱导P19CL6小鼠畸胎瘤干细胞分化为自发跳动的心肌细胞,检测自噬诱导剂雷帕霉素对小鼠P19CL6畸胎瘤细胞向心肌分化的影... 详细信息

目的:评价小分子化合物雷帕霉素、羟氯喹和MC1568对心肌分化效率和心肌分化转录因子Mef2c表达的影响。方法:利用DMSO诱导P19CL6小鼠畸胎瘤干细胞分化为自发跳动的心肌细胞,检测自噬诱导剂雷帕霉素对小鼠P19CL6畸胎瘤细胞向心肌分化的影响,研究相关机制。结果:自噬诱导剂雷帕霉素能够有效促进心肌分化,增强心肌标志性基因表达;自噬抑制剂羟氯喹能抑制DMSO诱导的P19CL6细胞心肌分化。雷帕霉素促进心肌分化转录因子Mef2c表达;采用Mef2c的小分子抑制剂MC1568,则能抑制雷帕霉素诱导的心肌早期和晚期分化标志基因表达。结论:雷帕霉素诱导的Mef2c表达是增强心肌分化能力所必需的。

关键词：干细胞心肌分化自噬雷帕霉素

三氯乙烯对人胚胎干细胞心肌分化的影响和机制

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中国应用生理学杂志 2015年第3期31卷 216-219,224页

作者：王丹陈涛王国卿姜岩苏州大学医学部江苏苏州215123

目的:探讨三氯乙烯(TCE)对人胚胎干细胞心肌发育分化的影响。方法:以人胚胎干细胞H9体外心肌定向分化为模型,分化培养液中添加不同剂量的TCE(分别为处理组100 ppb组,1 ppm组,10 ppm组)以及DMSO(对照组)。对诱导后形成的拟胚体以及不同... 详细信息

目的:探讨三氯乙烯(TCE)对人胚胎干细胞心肌发育分化的影响。方法:以人胚胎干细胞H9体外心肌定向分化为模型,分化培养液中添加不同剂量的TCE(分别为处理组100 ppb组,1 ppm组,10 ppm组)以及DMSO(对照组)。对诱导后形成的拟胚体以及不同发育阶段的细胞进行检测,通过MTT法测定细胞的生存能力,统计有自主节律跳动的拟胚体的数量;流式细胞仪计数分析细胞分化比例;荧光定量PCR检测心肌特异性基因表达;并应用基因芯片方法初步筛选检测三氯乙烯对心肌细胞钙离子通道相关的基因表达的影响。结果:TCE的三个浓度处理组均未显示细胞毒性,但高浓度组明显抑制向心肌细胞分化,能产生自主节律搏动的拟胚体比例显著降低,同时心肌特异性标记物c Tn T表达随剂量的增加而显著降低。在具有自主节律性的拟胚体中,钙离子通路的相关基因表达受到影响。结论:推测TCE通过降低成熟心肌的比例,以及影响心肌细胞中钙离子通道相关基因表达来共同导致心脏发育异常。

关键词：三氯乙烯人胚胎干细胞心肌分化基因表达钙离子通道

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1-磷酸鞘氨醇促进间充质干细胞向心肌分化

生物工程学报 2013年第11期29卷 1617-1628页

作者：姜丽丽刘天庆宋克东关水李香琴葛丹大连理工大学化工学院干细胞与组织工程研发中心辽宁大连116024 大连理工大学盘锦校区生命与医药学院辽宁盘锦124221

为研究1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)对脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)和脂肪间充质干细胞(Adipose derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)向心肌分化的影响,探索其适宜的作用时间和浓度,将UC-MSCs和AD-MSCs接种到培养板,用添加不同浓度S1P的心肌细胞培养液诱导两种干细胞向心肌分化,诱导时间分为7 d、14 d和28 d。采用免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白,α-肌动蛋白(α-actin)、缝隙连接蛋白(Connexin-43)以及肌球蛋白重链(MYH-6)的表达,并通过共聚焦显微镜和荧光显微镜进行观察;采用MTT分析细胞的活性;膜片钳检测分化细胞的钙瞬变(此为心肌细胞的功能性指标)。结果表明,S1P与心肌细胞培养液协同作用,能够促进UC-MSCs和AD-MSCs向心肌细胞的分化。并且,随着S1P浓度的增加,促分化作用增强,但细胞活性降低。S1P在心肌细胞培养液中的适宜作用时间为14 d,适宜作用浓度为0.5μmol/L。而且联合心肌细胞培养液可以使UC-MSCs和AD-MSCs的心肌分化细胞产生钙瞬变,具有类似心肌细胞的功能性。S1P能够与心肌细胞培养液协同作用,促进UC-MSCs和AD-MSCs的心肌功能性分化。

关键词：脐带间充质干细胞脂肪间充质干细胞心肌分化 1-磷酸鞘氨醇心肌细胞

脂肪间充质干细胞CD73亚群心肌分化能力评价

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解剖学报 2016年第1期47卷 49-54页

作者：张珉高建辉李琼余霞王晶晶郭志坤河南省肿瘤医院肝胆胰外科郑州450008 新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003

目的探讨CD73+和CD73-脂肪间充质干细胞(ADMSCs)两个亚群向心肌分化能力的差异,筛选出心肌分化优势亚群,为进一步开展细胞治疗心肌疾患提供实验参考。方法流式细胞仪分选CD73+/CD73-ADMSCs亚群,HE染色观测其形态。体外5-氮杂胞甙(5-aza... 详细信息

目的探讨CD73+和CD73-脂肪间充质干细胞(ADMSCs)两个亚群向心肌分化能力的差异,筛选出心肌分化优势亚群,为进一步开展细胞治疗心肌疾患提供实验参考。方法流式细胞仪分选CD73+/CD73-ADMSCs亚群,HE染色观测其形态。体外5-氮杂胞甙(5-aza)诱导CD73+/CD73-亚群,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白T(c Tn T),Real-time PCR检测c Tn T、Gata-4变化;4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记两个亚群后,移植到大鼠心肌内,免疫荧光法检测移植细胞c Tn T表达。结果 CD73+ADMSCs形态以小细胞为主呈细长形或纺锤状,CD73-细胞以宽大扁平或方形等为主。体外成心肌诱导后,CD73+ADMSCs心肌特异性c Tn T表达率为45.5%、CD73-亚群为5.75%,基因水平上CD73+亚群表达c Tn T、Gata-4明显高于阴性亚群(P心肌分化的潜能,CD73+ADMSCs可能更具有心肌治疗的前景。

关键词： CD73 心肌特异性肌钙蛋白T 心肌分化脂肪间充质干细胞流式细胞术小鼠

hHO-1联合GATA-4修饰大鼠骨髓间充质干细胞抗凋亡及向心肌分化的实验研究

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解放军医学杂志 2017年第4期42卷 314-319页

作者：邓宁波曾元清韩腾龙蒋知新南方医科大学研究生院广州510515 郴州市第一人民医院高通量分子诊断技术国家&地方联合工程实验室湖南郴州423000 解放军305医院中心实验室北京100017

目的探讨经人血红素加氧酶1(hHO-1)基因和GATA-4基因联合修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧环境中抗凋亡及体外分化为心肌细胞样细胞的能力是否优于hHO-1或GATA-4单基因修饰的BMSCs。方法采用全骨髓贴壁法分离、培养BMSCs并... 详细信息

目的探讨经人血红素加氧酶1(hHO-1)基因和GATA-4基因联合修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧环境中抗凋亡及体外分化为心肌细胞样细胞的能力是否优于hHO-1或GATA-4单基因修饰的BMSCs。方法采用全骨髓贴壁法分离、培养BMSCs并进行鉴定,重组腺病毒转染BMSCs,Western blotting法确定基因表达的最佳时间;以缺氧无血清条件模拟体内缺血缺氧微环境培养基因修饰的BMSCs,采用CCK-8试剂盒和台盼蓝染色法分别检测缺血缺氧培养12、24、48、72h细胞存活率,流式细胞术检测缺血缺氧培养24h细胞凋亡情况,Western blotting及细胞免疫荧光法检测特异性心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达情况。结果缺血缺氧培养12、24、48、72h的hHO-1+GATA-4组细胞生存率均高于hHO-1组(P心肌细胞分化的能力。

关键词：间质干细胞基因,GATA4 血红素加氧酶-1 心肌分化

二甲亚砜诱导人骨髓基质干细胞心肌分化中的基因表达

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复旦学报（医学版） 2004年第5期31卷 454-457,F002页

作者：史剑慧胡昕婴牛玉宏葛均波复旦大学附属中山医院-上海市心血管病研究所实验中心上海200032

目的　研究二甲亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)诱导人骨髓基质细胞 (humanbonemarrowstromalcells ,hBMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子和心肌基因的表达变化。方法　取第 8代hBMSC ,以DMSO诱导 2 4h。在诱导后 2 1天 ,通过免疫荧... 详细信息

目的　研究二甲亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)诱导人骨髓基质细胞 (humanbonemarrowstromalcells ,hBMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子和心肌基因的表达变化。方法　取第 8代hBMSC ,以DMSO诱导 2 4h。在诱导后 2 1天 ,通过免疫荧光染色检测干细胞标志CD90和肌性标志Desmin表达变化 ,并在诱导后1、2、3周提取RNA。以RT PCR方法检测细胞心肌特异转录因子 (Nkx2 .5和GATA4 )和特异基因 (connexin4 3、ANP等 )的表达变化。结果　经DMSO诱导后 ,MSC体积变大 ,细胞排列趋于一致 ,连接紧密 ,并逐渐形成肌节样结构 ,CD90阳性细胞减少 ,Desmin阳性细胞增加。在DMSO诱导hBMSC后 1周 ,开始可检测到细胞发生转录水平变化 (Nkx2 .5、GATA - 4表达和connexin4 3、ANP表达 ) ,并均可持续至诱导后 3周 ;前三者的表达量有随诱导后时间延长而增加的趋势。结论　DMSO在体外可诱导hBMSC向心肌前体细胞分化。

关键词：诱导表达心肌分化 BMSC 转录因子 connexin43 人骨髓基质干细胞转录水平特异基因 DMSO