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FSP1在低铁饮食保护SD大鼠对抗心肌缺血再灌注所致急性损伤的作用研究

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FSP1在低铁饮食保护SD大鼠对抗心肌缺血再灌注所致急性损伤的作用...

作者：洪玉娇南昌大学

学位级别：硕士

目的:在动物水平上揭示长期低铁饮食对心肌缺血再灌注（I/R）损伤具有保护作用,这一保护作用由铁死亡抑制蛋白（FSP1）所介导,从低铁饮食及抑制铁死亡角度为防治心肌I/R损伤提供新的靶点及途径。方法:采用SD大鼠,给予低铁和高铁饮食干预... 详细信息

目的:在动物水平上揭示长期低铁饮食对心肌缺血再灌注（I/R）损伤具有保护作用,这一保护作用由铁死亡抑制蛋白（FSP1）所介导,从低铁饮食及抑制铁死亡角度为防治心肌I/R损伤提供新的靶点及途径。方法:采用SD大鼠,给予低铁和高铁饮食干预,并且采用心肌内五点注射法将FSP1慢病毒转染至大鼠体内,行缺血0.5h,再灌注2h,以实现SD大鼠心肌I/R损伤模型的构建。分组为:Sham group（假手术组）;I/R group（缺血/再灌注组）;I/R+IDD group（低铁饮食+缺血/再灌注组）;I/R+IHD group（高铁饮食+缺血/再灌注组）;I/R+IDD+NC group（低铁饮食+缺血/再灌注组+空载质粒组）;I/R+IHD+NC group（高铁饮食+缺血/再灌注组+空载质粒组）;I/R+IDD+LV-FSP1-RNAi group（低铁饮食+缺血/再灌注组+FSP1敲减组）,I/R+IHD+LV-FSP1 group（高铁饮食+缺血/再灌注组+FSP1高表达组）其中每组各6只进行试验。1.首先通过吉凯公司构建LV-FSP1、LV-FSP1-RNAi慢病毒,为筛选出选择性最高的基因序列,LV-FSP1-RNAi慢病毒共构建了三条序列,阴性对照（negative control,简称NC）病毒带绿色荧光（GFP）,在感染H9c2细胞后可在荧光倒置显微镜下观察到NC的荧光表达情况,根据荧光表达选出病毒转染的最佳感染体系和最佳复感染指数（MOI值）,进行免疫印迹实验,根据显示的结果即可筛选出沉默FSP1蛋白效果最佳的病毒序列。2.构建低铁、高铁饮食模型,选取21天断乳雄性SD大鼠给予铁饮食饲料8周,其中高铁饮食组（IHD）铁含量为1000ppm,低铁饮食组（IDD）铁含量45ppm,正常铁饮食组（IAD）铁含量70ppm,取血测定SD大鼠体内血红蛋白（Hb）及血清铁（SI）,取心肌组织匀浆测定心肌组织铁,同时测量心脏/体重,验证高铁低铁饮食模型建立成功。3.采用心肌内5点注射法使大鼠心脏转染带绿色荧光（GFP）的LV-FSP1、LV-FSP1-RNAi慢病毒,以同样的方法在心肌内注射不带绿色荧光的阴性对照慢病毒以作为对照。慢病毒在体内转染15天后,达到最高转染效率,此时取心肌样本进行OCT包埋后做冰冻切片,并迅速置于荧光倒置显微镜下观察各组荧光表达情况,以验证转染效果。4.向SD大鼠心肌内注射不同剂量的LV-FSP1及LV-FSP1-RNAi慢病毒,以确定病毒的最佳转染剂量,同时设置假手术组和心肌内注射阴性对照慢病毒组以作为对照。病毒在大鼠体内转染15天后取实验组SD大鼠心肌组织提取蛋白,进行Western Blotting检测FSP1表达情况,选择大鼠能够承受且沉默或过表达目的蛋白效果最佳的剂量来作为后续实验的注射剂量。5.构建I/R模型,我们在连接呼吸机的情况下结扎SD大鼠左冠状动脉前降支,观察二导联心电图显示缺血情况,在缺血0.5h后行再灌注2h。6.1%TTC染色法检测在不同分组处理下心肌的梗死面积,HE染色法评估心肌细胞的损伤情况,MASSON染色法检测心肌细胞纤维化水平,Perls染色检测含铁血黄素沉积情况。并检测FSP1蛋白在不同处理下的表达情况。7.提取到各组SD大鼠的血清之后,经相应的试剂盒检测血清中MDA水平和LDH、SOD、GSH-Px的活性。结果:1.在H9c2细胞中筛选出慢病毒LV-FSP1-RNAi敲减效果最佳的序列为LV-FSP1-RNAi-（95947-11）,阴性对照组慢病毒对FSP1蛋白表达水平无明显影响。摸索慢病毒转染的最佳条件为:MOI为20,含10%FBS的DMEM培养基+Hi Trans G P的条件下感染72 h。2.选取21天断乳的雄性SD大鼠喂食含铁量不同的饲料8周后检测发现,低铁饮食组SI、Hb和心脏组织铁含量低于标准铁组,且低铁饮食组未发生贫血,而高铁饮食组SI、Hb和心脏组织铁含量远远高于这一标准铁组。将大鼠心脏取下后称重,发现低铁饮食大鼠心脏/体重比更高。这些数据表明8周给予不同铁含量的饲料可以造成大鼠体内铁含量的变化,低铁、高铁饮食模型建立成功。3.将构建好的LV-FSP1、LV-FSP1-RNAi慢病毒注入SD大鼠心脏,转染14天后取组织制成冰冻切片,我们观察到在同样的曝光时间内,注射阴性空载慢病毒组未观察到明显荧光,注射带绿色荧光慢病毒组可见明显绿色荧光。表明慢病毒在SD大鼠心肌内成功转染。4.注射不同剂量慢病毒,检测心肌FSP1的表达,结果表明心肌内注射过表达载体LV-FSP1慢病毒剂量为32.5μL（滴度:2.5×10^9TU/m L）时,FSP1蛋白明显表达上调,且此剂量大鼠可耐受。当心肌内注射LV-FSP1-RNAi慢病毒25μL（滴度:2×10^9 TU/m L）时,能明显敲减FSP1的表达,阴性空载慢病毒对FSP1蛋白表达水平无明显影响。5.

关键词：缺血/再灌注（I/R）铁死亡抑制蛋白（FSP1）心肌内注射低铁饮食高铁饮食铁死亡

14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin通路在内毒素耐受交叉保护SD大鼠心肌缺血/再灌注损伤的机制研究

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14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin通路在内毒素耐受交叉保护SD...

作者：胡文锋南昌大学

学位级别：硕士

目的:在动物水平上揭示受14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin调控的炎症相关信号通路网络,以进一步阐明内毒素耐受交叉保护心肌I/R损伤的主要机制,从抗炎角度为防治心脏I/R的损伤提供新的靶点。方法:我们采用的是SD大鼠,心肌内注射转... 详细信息

目的:在动物水平上揭示受14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin调控的炎症相关信号通路网络,以进一步阐明内毒素耐受交叉保护心肌I/R损伤的主要机制,从抗炎角度为防治心脏I/R的损伤提供新的靶点。方法:我们采用的是SD大鼠,心肌内注射转染慢病毒,构建整体I/R损伤模型。分组为:Sham group;I/R group;LPS+I/R group;NC+LPS+I/R group;siRNA14-3-3γ+LPS+I/R group,其中每组各10只进行试验。1.首先构建了siRNA-14-3-3γ慢病毒,然后采用心肌内5点注射法使大鼠心脏转染带绿色荧光（GFP）的阴性对照（negative control,简称NC）慢病毒。作为对照,我们以同样的方法使大鼠心脏转染不带绿色荧光的阴性对照慢病毒。15天后,取心肌样本用OCT包埋后做冰冻切片。在固定曝光时间的条件下,观察各组荧光表达情况。2.为了寻找最合适的病毒转染剂量,我们分别将不同剂量的siRNA-14-3-3γ慢病毒转染至大鼠左心室心肌内,并以假手术组和心肌内注射阴性对照慢病毒组为对照。15天后取心肌组织提取蛋白,检测14-3-3γ表达情况,根据沉默目的蛋白效果较好且大鼠能承受的剂量作为慢病毒转染剂量。3.为了构建内毒素耐受保护模型,我们腹腔注射不同剂量的LPS进行预处理,24 h后行I/R损伤处理,检测心肌组织14-3-3γ表达情况,筛选出能使14-3-3γ蛋白表达量最高的给药剂量,从而构建内毒素耐受保护模型。4.1%TTC染色法检测在不同处理下心肌的梗死面积,HE染色法评估心肌细胞的损伤情况,TUNEL法检测心肌细胞的凋亡情况,并采用Western Blotting法检测14-3-3γ、phospho-GSK3β和β-catenin蛋白在不同处理下的表达情况及采用免疫共沉淀法检测14-3-3γ与phospho-GSK3β之间的相互作用关系。5.提取各处理组的血清之后,检测血清中LDH、GSH-PX、SOD和MDA的活性;最后用Elisa法检测TNF-α和IL-6的分泌水平。结果:1.我们构建的siRNA-14-3-3γ慢病毒序列为Ywhag-RNAi（44876-1）,在同样曝光时间内,我们观察到注射不带荧光阴性空载慢病毒的心肌组织冰冻切片无明显荧光,而注射带绿色荧光阴性空载慢病毒的心肌组织冰冻切片有明显的绿色荧光。证实心肌内5点注射法能将慢病毒成功转染至大鼠心肌内。2.经不同剂量慢病毒注射后检测心肌14-3-3γ表达情况,结果显示当心肌内注射病毒剂量为60μL（病毒滴度:5×10?8 TU/m L）时,对14-3-3γ表达有明显沉默效果,且阴性对照组慢病毒对14-3-3γ蛋白表达无明显影响。3.经不同剂量的LPS预处理后,取心肌组织采用Western Blotting法检测14-3-3γ表达情况,结果显示:当我们预处理给予的LPS剂量为0.5mg/kg时,14-3-3γ表达水平最高。前期我们实验已经证实当给予小剂量LPS预处理后,14-3-3γ蛋白表达水平增加,故我们选取预先给予的LPS剂量为0.5mg/kg构建SD大鼠内毒素耐受模型。4.与I/R组相比,1%TTC染色结果显示:LPS+I/R、NC+LPS+I/R组的心肌梗死面积明显减小,当心肌内注射慢病毒后,内毒素耐受交叉保护作用被逆转。与I/R组相比,HE染色和TUNEL法检测结果显示:LPS+I/R、NC+LPS+I/R组的心肌细胞肿胀与变形程度明显降低,且心肌细胞的凋亡水平明显降低,当心肌内注射慢病毒后,内毒素耐受交叉保护作用被逆转。与I/R组相比,Western Blotting检测结果显示:LPS+I/R、NC+LPS+I/R组的14-3-3γ、phospho-GSK3β和β-catenin蛋白表达水平明显增加,表明在LPS预处理后14-3-3γ、phospho-GSK3β和β-catenin的蛋白浓度显著升高。Co-IP结果显示,只有在LPS预处理后,14-3-3-γ和phospho-GSK3β才会出现相互作用。5.检测血清中LDH、MDA、GSH-PX、SOD、TNF-α和IL-6的活性结果显示,与I/R组相比LPS+I/R、NC+LPS+I/R组的LDH、MDA、TNF-α和IL-6的活性明显降低,GSH-PX和SOD活性明显升高。而心肌内注射siRNA14-3-3γ慢病毒后,内毒素耐受交叉保护作用被逆转。结论:内毒素耐受对SD大鼠心肌I/R损伤处理后存在保护作用,其作用是通过14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin调控炎症相关信号通路网络,从而影响炎性相关基因的转录和翻译,最终产生保护作用。

关键词：脂多糖（LPS）内毒素耐受心肌内注射缺血/再灌注（I/R） 14-3-3γ β-catenin GSK3

心肌内注射碱性成纤维生长因子促进缺血心肌血管生成的实验研究

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中华放射学杂志 2004年第5期38卷 529-533页

作者：孙立军刘莹赵海涛宦怡葛亚丽郜发宝第四军医大学西京医院放射科西安710032

目的　探讨心肌内注射碱性成纤维生长因子 (bFGF)对急性心肌梗死血管生成的作用。方法　 2 4只健康杂种犬随机数字表法分成对照组和实验组 ,结扎冠状动脉左前降支第一对角支下0 5cm处。每组按 4个时间点 (术后第 1、3、10、17天 )分为 ... 详细信息

目的　探讨心肌内注射碱性成纤维生长因子 (bFGF)对急性心肌梗死血管生成的作用。方法　 2 4只健康杂种犬随机数字表法分成对照组和实验组 ,结扎冠状动脉左前降支第一对角支下0 5cm处。每组按 4个时间点 (术后第 1、3、10、17天 )分为 4个小组 ;实验组在梗死心肌区 5个位点注射bFGF 5 0mg+生理盐水共 15ml,对照组在相同部位注射生理盐水共 15ml。各组动物在处死前采用敏感编码 (SENSE)技术行MR电影和心肌灌注MR成像 ;电子显微镜观察新生血管生长 ;免疫组织化学方法检测微血管数量。结果　实验组左心室射血分数自第 10天明显增加 (第 10天 :对照组 2 4 0 9± 3 32、实验组 4 5 71± 6 2 7;第 17天 :对照组 31 4 6± 4 6 0、实验组 5 3 4 6± 5 2 4 ) (P 心肌首过灌注呈低强化 ,延迟扫描信号强度高于正常心肌 ,曲线上升时间、峰值时间、曲线上升斜率、对比增强率低于正常心肌 ;第 17天时心肌梗死范围百分比显著变小 [对照组 (9 0 4± 1 5 9) %、实验组 (4 0 7± 1 2 0 ) % ](P <0 0 5 ) ;实验组微血管生长活跃 ,其数量除第 1天外余各个时间点实验组均比对照组明显增多 ,对照组与实验组分别为第 3天 :(92 3± 11 6 )个 /视野、(14 7 3± 11 6 )个 /视野 ;第 10天 :(12 5 0±

关键词：心肌内注射碱性成纤维生长因子缺血心肌血管生成实验研究心肌再灌注磁共振显像

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多功能心腔内超声导管性能的初步测试

中国医学影像技术 2010年第12期26卷 2379-2381页

作者：郭睿黄晶钱俊刘地川蔡恒辉杨金耀刘炯斌郭境峰成正辉曾德平王志刚重庆医科大学超声影像学研究所重庆医科大学附属第二医院心血管内科重庆400010 汕头超声仪器研究所广东汕头515041 湖南埃普特医疗器械有限公司湖南湘乡411400 重庆海扶技术有限公司重庆401121

目的在离体条件下重点测试自行设计研发的多功能心腔内超声导管操控性能、超声辐照换能器工作情况,实时监控心肌内注射的能力。方法分别运用精密阻抗仪及超声声功率计测试超声辐照换能器的工作频率及声功率,然后将多功能心腔内超声导管... 详细信息

目的在离体条件下重点测试自行设计研发的多功能心腔内超声导管操控性能、超声辐照换能器工作情况,实时监控心肌内注射的能力。方法分别运用精密阻抗仪及超声声功率计测试超声辐照换能器的工作频率及声功率,然后将多功能心腔内超声导管送入离体猪心左心室,并在左心室游离壁测试多功能心腔内超声导管在心肌内注射时对实时监控注射针进针深度及指导微泡注射的能力。结果该10F多功能心腔内超声导管能够实现单向弯曲;集成心腔内超声成像、心肌内注射、超声辐照和电生理标测功能,超声辐照换能器频率和声功率分别为7.2MHz和0.28W,能够实时监控进针深度及微泡分布情况。结论本研究设计的多功能心腔内超声导管可能为经心内膜药物投递提供更为安全、有效的治疗方案。

关键词：多功能超声心动描记术导管心肌内注射离体

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自体骨髓细胞心肌内注射治疗缺血性心脏病

武汉大学学报（医学版） 2011年第6期32卷 783-785页

作者：陈治国陈宝钧赵轲武汉市中心医院心胸外科湖北武汉430014

目的:研究冠脉搭桥术(CABG)中直视下心肌内注射移植骨髓单个核细胞治疗缺血性心脏病的可行性和疗效。方法:入选经冠状动脉造影确诊的冠心病患者24例,随机分为骨髓干细胞移植组(12例)和对照组(12例)。移植组除常规手术治疗外,同期术中将... 详细信息

目的:研究冠脉搭桥术(CABG)中直视下心肌内注射移植骨髓单个核细胞治疗缺血性心脏病的可行性和疗效。方法:入选经冠状动脉造影确诊的冠心病患者24例,随机分为骨髓干细胞移植组(12例)和对照组(12例)。移植组除常规手术治疗外,同期术中将骨髓单个核细胞悬液分多点注射到缺血心肌内。对照组仅采用常规手术治疗。用经胸超声心动图和单光子放射计算机断层显像术(SPECT)比较两组治疗前、后超声指标和心肌灌注缺损区面积。结果:术后随访1年,经胸超声心动图显示,与术前及对照组术后相比,移植组左室射血分数等指标明显改善(P心肌灌注缺损面积明显降低(P心肌内注射移植骨髓干细胞治疗缺血性心脏病安全可行,术后能改善左室收缩功能及心肌血流灌注。

关键词：自体骨髓单个核细胞缺血性心脏病心肌内注射

缺血性心脏病患者接受骨髓单个核细胞移植治疗方案的临床研究

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世界复合医学 2021年第3期7卷 4-7页

作者：回艳平菏泽开发区中心医院心内科山东菏泽274000

目的探究缺血性心脏病患者接受骨髓单个核细胞移植治疗方案的临床效果。方法择选该院2016年1月—2019年1月收治的经冠状动脉造影确诊冠心病患者40例为研究对象,按随机分组原则由计算机分组工具,自动均分为研究组和对照组,每组20例。治疗... 详细信息

目的探究缺血性心脏病患者接受骨髓单个核细胞移植治疗方案的临床效果。方法择选该院2016年1月—2019年1月收治的经冠状动脉造影确诊冠心病患者40例为研究对象,按随机分组原则由计算机分组工具,自动均分为研究组和对照组,每组20例。治疗后,分别就两组患者的超声指标和心肌灌注缺损区面积变化情况实施对比,评价两种方法的疗效。结果治疗后,研究组患者LVEDV(101.5±7.1)mL、LVESV(56.3±5.8)mL、LVEF(43.8±5.7)%优于对照组的(106.3±8.8)mL、(61.7±6.7)mL、(56.3±5.9)%,差异有统计学意义(t=2.198、2.725、6.814,P心肌灌注缺损面积(15.2±6.3)%多于对照组(21.4±6.7)%,差异有统计学有意义(t=3.014,P<0.05)。结论缺血性心脏病患者行骨髓单个核细胞移植治疗,疗效较为显著,有利于患者左室收缩功能的改善,且安全性良好,具有较高的应用价值。

关键词：缺血性心脏病骨髓单个核细胞移植心肌内注射疗效

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以多功能心腔内导管行犬心肌内注射的可行性

中国介入影像与治疗学 2012年第8期9卷 625-628页

作者：杨亚黄晶钱俊郭睿蔡恒辉杨金耀成正辉王志刚重庆医科大学附属第二医院心血管内科重庆400010 汕头超声仪器研究所广东汕头515041 湖南埃普特医疗器械有限公司湖南湘乡411400 重庆医科大学超声影像学研究所重庆400010

目的检测以多功能心腔内导管对活体犬行心肌内注射的可行性和安全性。方法将12只健康杂种犬随机分为3组,在超声心动图模式下引导多功能心腔内导管进入左心室,在心腔内超声模式下监控注射针插入左心室前壁及室间隔,并注射伊文思蓝染料,... 详细信息

目的检测以多功能心腔内导管对活体犬行心肌内注射的可行性和安全性。方法将12只健康杂种犬随机分为3组,在超声心动图模式下引导多功能心腔内导管进入左心室,在心腔内超声模式下监控注射针插入左心室前壁及室间隔,并注射伊文思蓝染料,剂量分别为0.4ml、0.8ml和1.2ml。3h后处死动物取出心脏,观察注射点与超声图像的位置关系,计算染色心肌的体积,并对各组进行比较。结果多功能心腔内导管顺利进入心室,能对心肌结构进行识别,有效监控注射针对心肌进行靶向注射。各组染色心肌体积差异有统计学意义。注射相同剂量的染料在左心室前壁与室间隔形成的染色心肌体积差异无统计学意义。结论本研究设计的多功能心腔内导管系统与超声心动图整合后基本达到预期目标,可能为心肌内干细胞或基因注射提供更为安全、有效的途径。

关键词：多功能导管超声心动描记术心肌内注射

一种不依赖呼吸机的小鼠心肌内注射技术的建立

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医学研究杂志 2016年第4期45卷 32-36页

作者：张逸杰戴明彦曹权陈俊婷包明威武汉大学人民医院心内科、武汉大学心血管病研究所 430060

目的建立一种简洁高效、不依赖辅助通气的小鼠心肌内注射的实验方法,并浅析操作细节及技巧。方法 44只6周龄的雄性C57BL/6J小鼠,随机分为实验组(22只)和对照组(22只)。麻醉后于左侧第4肋间隙挤出心脏,向左心室壁内注射靶向CPT-1b(实验组... 详细信息

目的建立一种简洁高效、不依赖辅助通气的小鼠心肌内注射的实验方法,并浅析操作细节及技巧。方法 44只6周龄的雄性C57BL/6J小鼠,随机分为实验组(22只)和对照组(22只)。麻醉后于左侧第4肋间隙挤出心脏,向左心室壁内注射靶向CPT-1b(实验组)或靶向无关基因(对照组)的重组慢病毒。10周后,取心脏及后肢骨骼肌,行RT-PCR及Western blot法,检测不同组织中CPT-1b的mRNA及蛋白表达水平。结果至16周龄,小鼠存活率90.9%。实验组小鼠心肌中CPT-1b的表达显著低于对照组,而骨骼肌中CPT-1b的表达在两组间没有统计学差异。结论心肌内注射技术所介导的RNA干扰高效、特异地下调了心肌组织中目标基因的表达,该技术是一种较好的将外源物质定向导入心肌组织的方法。

关键词：小鼠心肌内注射 RNA干扰动物模型手术效率

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影像学方法指导心肌内注射研究进展

心血管病学进展 2011年第2期32卷 246-249页

作者：钱俊黄晶重庆医科大学附属第二医院心血管内科重庆400010

关于心肌内注射促血管新生物质治疗缺血性心脏疾病的研究早已开展,由于其属于介入性治疗手段,所以需要影像学技术支持引导导管进入心腔,并监控注射过程。目前使用的各种影像学方法都具有其优点,但又存在不足。现将就当前主要的影像学引... 详细信息

关于心肌内注射促血管新生物质治疗缺血性心脏疾病的研究早已开展,由于其属于介入性治疗手段,所以需要影像学技术支持引导导管进入心腔,并监控注射过程。目前使用的各种影像学方法都具有其优点,但又存在不足。现将就当前主要的影像学引导方法的研究现状做一综述。

关键词：影像学心肌内注射