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三维预血管化微组织中成纤维细胞促进内皮细胞出芽及迁移的研究

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中国修复重建外科杂志 2022年第7期36卷 881-888页

作者：唐珺谈金女叶朝阳周燕谭文松华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

目的构建三维预血管化微组织,探索三维共培养体系中人成纤维细胞(human fibroblasts,HFs)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)出芽和迁移的促进作用。方法取HUVECs和HFs培养传代至3~5代进行实验。在... 详细信息

目的构建三维预血管化微组织,探索三维共培养体系中人成纤维细胞(human fibroblasts,HFs)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)出芽和迁移的促进作用。方法取HUVECs和HFs培养传代至3~5代进行实验。在二维共培养体系中,将HFs行PKH26染色且固定细胞密度后,与HUVECs以不同比例(1∶4、1∶1、4∶1)以及不同接种方式(两种细胞间隔48 h顺序接种、直接混合接种)共培养,荧光显微镜下观察血管网络形成情况。构建三维共培养体系,通过慢病毒转染分别用绿色和红色荧光蛋白标记HUVECs和HFs,将标记细胞接种于多孔微载体上,采用转瓶动态培养,分别制备HF微组织、HUVEC微组织、HF-EC微组织和HF&EC微组织;低渗结晶紫染色法观测微组织中细胞生长情况。将各微组织包埋于纤维蛋白凝胶中,激光共聚焦显微镜下观察HF微组织和HUVEC微组织中细胞生长贴附情况,4种微组织出芽情况以及HF-EC微组织、HF&EC微组织芽体细胞组成、出芽数量及芽体长度。制备HFs条件培养基,观察其对HUVEC微组织出芽的影响,以正常培养基培养作为对照。结果二维共培养时HFs预培养有助于血管网状结构形成与稳定,且当两种细胞比例为1∶1时效果最佳。三维共培养时各微组织上细胞生长良好,HUVEC微组织无出芽,HF微组织、HF-EC微组织、HF&EC微组织均能出芽,具备良好血管化能力。HF-EC微组织芽体长度及出芽数目均优于HF&EC微组织(P微组织中HF微组织先于HUVEC微组织出芽,两者出芽轨迹一致,芽体由HFs和HUVECs组成。在HFs条件培养基中,HUVEC微组织也能出芽。结论在转瓶中按1∶1比例顺序接种HFs和HUVECs可制备HF-HUVEC预血管化微组织,且在三维共培养中HFs能够引导和促进HUVECs出芽及迁移。

关键词：组织工程微组织预血管化转瓶动态培养三维共培养

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水凝胶在微组织构建中的应用与进展

中华整形外科杂志 2020年第4期36卷 462-465页

作者：罗超汪振星孙家明华中科技大学同济医学院附属协和医院整形外科武汉430000

组织工程学在组织器官缺损修复展现了巨大前景。但是,传统组织工程构建方法存在组织复杂、精细微结构构建困难、种子细胞分布不均的难题。基于微凝胶的微组织技术可在微尺度精细模拟组织微结构,且可通过组装的方式实现种子细胞在移植物... 详细信息

组织工程学在组织器官缺损修复展现了巨大前景。但是,传统组织工程构建方法存在组织复杂、精细微结构构建困难、种子细胞分布不均的难题。基于微凝胶的微组织技术可在微尺度精细模拟组织微结构,且可通过组装的方式实现种子细胞在移植物上的均匀分布。微凝胶的成分大体可分为天然水凝胶来源和人工水凝胶来源,该文根据成分来源进行分类,对不同水凝胶在微组织构建中的应用与进展做一综述,以期对组织工程相关研究人员提供参考。

关键词：组织工程微组织水凝胶

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微组织修复大鼠坐骨神经缺损的早期实验研究

解放军医学院学报 2022年第1期43卷 87-94页

作者：张健李超超孟繁琪管延军杨博尧张铁元任致奇刘修志赵杰杨凯王玉彭江解放军医学院北京100853 解放军总医院骨科研究所北京100853 北京大学人民医院脊柱外科北京100044 解放军总医院神经外科北京100853 北京清华长庚医院血管外科北京102218 解放军93685部队医院河北张家口075000

背景微组织是种子细胞在细胞-细胞或细胞-细胞外基质(extracellular matrix,ECM)作用下聚集而成的微型组织,这种三维培养方式有利于提高细胞活性,提高组织修复效果,然而神经组织工程中微组织的研究却很少。目的将脂肪来源间充质干细胞(a... 详细信息

背景微组织是种子细胞在细胞-细胞或细胞-细胞外基质(extracellular matrix,ECM)作用下聚集而成的微型组织,这种三维培养方式有利于提高细胞活性,提高组织修复效果,然而神经组织工程中微组织的研究却很少。目的将脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ASCs)构建成微组织,探索微组织对大鼠坐骨神经缺损模型的早期修复效果。方法提取ASCs进行鉴定;利用悬浮液滴法和低黏附细胞培养板法构建微组织,并对其性质进行研究;将微组织与大鼠背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)进行直接和间接共培养,观察微组织对DRG轴突生长的影响;利用静电纺丝机构建聚己内酯(polycaprolactone,PCL)神经导管,并验证其取向性;最后取SD大鼠24只,随机分为空导管组、2D细胞组、微组织组和自体神经移植组,每组6只。构建坐骨神经1 cm缺损模型,分别采用PCL导管桥接后注射培养基、PCL导管桥接后注射2D ASCs、PCL导管桥接后注射微组织和自体神经反向移植。术后4周取出神经移植物进行组织学评价。结果成功提取ASCs,能够表达间充质干细胞表面标记蛋白CD73、CD90、CD105。微组织构建后,对其形态和直径进行连续7 d的动态观察,微组织的直径与细胞数量呈正相关,且随着培养时间延长,微组织呈现“压实”的状态,直径逐渐变小。在微组织和DRG间接共培养体系中,微组织组的轴突长度明显长于2D细胞组(P微组织和DRG直接共培养体系中,DRG发出的轴突与附近的微组织紧密相连。PKH26标记的ASCs在PCL薄膜上呈取向性排列。动物实验结果表明,微组织组轴突生长明显优于2D细胞组(P微组织可促进DRG轴突生长,有效促进坐骨神经缺损大鼠模型的神经再生。

关键词：周围神经损伤间充质干细胞微组织三维细胞培养神经导管大鼠

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三维动静态培养软骨源性微组织的细胞行为及软骨形成能力

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中国组织工程研究 2024年第25期28卷 4022-4026页

作者：刘伟蒋洪宇陈嘉杰高宇阳管延军贾志博焦颖华真蒋格涵何莹汪爱媛彭江亓建洪山东第一医科大学(山东省医学科学院)运动医学与康复学院山东省泰安市271000 解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所北京市100853

背景:与传统二维培养相比,三维培养软骨微组织具有更大的优势,但仍需进一步探索更有利的三维培养方式。目的:评价2种三维培养方式下微组织的细胞行为及促软骨形成能力。方法:通过化学脱细胞方法和组织粉碎方法制备软骨源性微载体,采用DN... 详细信息

背景:与传统二维培养相比,三维培养软骨微组织具有更大的优势,但仍需进一步探索更有利的三维培养方式。目的:评价2种三维培养方式下微组织的细胞行为及促软骨形成能力。方法:通过化学脱细胞方法和组织粉碎方法制备软骨源性微载体,采用DNA定量和核染色验证脱细胞是否成功,通过组织学染色观察脱细胞前后基质保留情况,采用扫描电子显微镜和CCK-8方法对微载体进行表征;通过三维静态培养法和三维动态培养法将软骨源性微载体与人脂肪间充质干细胞结合构建软骨源性微组织,利用扫描电子显微镜、活死染色、RT-qPCR等手段检测两组微组织的细胞活力及成软骨能力。结果与结论:①成功制备软骨源性微载体,与脱细胞前相比,脱细胞后DNA含量显著降低(P微镜观察微载体表面有胶原包绕,保持天然软骨细胞外基质特征;CCK-8法检测表明微载体无细胞毒性且能够促进细胞增殖;②扫描电子显微镜及活死染色结果显示,相比三维静态组,三维动态组微组织细胞具有更舒展的形态,细胞与细胞间、细胞与基质间、基质与基质间形成广泛的连接;③RT-qPCR结果表明两组微组织SOX9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达在培养7 d或14 d时均增高;14 d时三维动态组各基因相对表达量均显著高于三维静态组(P微组织相比,三维动态培养微组织可在更短时间实现软骨相关基因的高表达,显示出更好的细胞活性和成软骨能力。

关键词：关节软骨损伤组织工程人脂肪间充质干细胞微组织三维动态培养

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基于微阵列芯片的开放式多孔微组织构建

中华整形外科杂志 2019年第4期35卷 355-360页

作者：杨昌罗超汪振星孙家明华中科技大学同济医学院附属协和医院整形外科武汉430022

目的探讨一种适合大鼠骨髓间充质干细胞生长的、具有开放式多孔结构的微组织及其最佳尺寸。方法采用激光打孔的方法构建1 500 μm和800 μm 2种孔径的聚甲基丙烯酸甲酯微阵列芯片。将明胶溶液经化学交联后均匀涂抹在微阵列芯片中,冷冻干... 详细信息

目的探讨一种适合大鼠骨髓间充质干细胞生长的、具有开放式多孔结构的微组织及其最佳尺寸。方法采用激光打孔的方法构建1 500 μm和800 μm 2种孔径的聚甲基丙烯酸甲酯微阵列芯片。将明胶溶液经化学交联后均匀涂抹在微阵列芯片中,冷冻干燥16 h后,利用对应的顶针阵列顶出微阵列芯片中的微凝胶。扫描电镜观察微观结构,并对2种直径的微凝胶进行孔径和孔隙率的检测。随后,将第3代大鼠骨髓间充质干细胞以5×106/ml浓度接种至微凝胶上,体外培养7 d后,得到微组织,进行活/死细胞染色检测微组织上细胞存活状况,并用扫描电镜观察微组织上细胞生长状况和细胞外基质分泌状况。结果扫描电镜显示微阵列芯片能够成功制备表面具有开放式多孔结构的微凝胶,1 500 μm微凝胶的孔径和孔隙率是800 μm微凝胶的1.5倍左右。接种BMSCs 7 d后,活/死细胞染色显示1 500 μm微组织上细胞数量更多,荧光定量分析显示1 500 μm微组织上细胞活性约为800 μm明胶微组织的4倍左右;扫描电镜显示1 500 μm微组织上细胞形态良好,且周边有分泌的细胞外基质。结论通过设计并制作的微阵列芯片成功构建了开放式多孔微凝胶,并且利用此微凝胶成功构建出开放式多孔微组织;相比于800 μm微组织,1 500 μm微组织上细胞活性更好。

关键词：微阵列芯片微组织明胶组织工程

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由微组织灌注培养构建具通道的工程化组织

由微组织灌注培养构建具通道的工程化组织

作者：焦清灵华东理工大学

学位级别：硕士

为了构建具血管通道的工程化组织,以解决工程化组织中传质限制的问题,在本实验室前期进行了多通道工程化组织体外构建的可行性研究的基础上,基于微构重塑技术对微组织进行灌注培养,进一步认识灌注培养过程中操作参数对组织构建过程和构... 详细信息

为了构建具血管通道的工程化组织,以解决工程化组织中传质限制的问题,在本实验室前期进行了多通道工程化组织体外构建的可行性研究的基础上,基于微构重塑技术对微组织进行灌注培养,进一步认识灌注培养过程中操作参数对组织构建过程和构建的具通道组织的组织性能的影响,为今后设计通道内皮化策略并实现通道的内皮化、构建具血管通道的工程化组织提供基础数据。本实验以微组织作为构建单元,通过灌注培养,构建单通道组织,即管状组织。考察构建过程中微组织初始堆积密度、灌注培养时间等操作参数对管状组织形成过程中细胞代谢以及构建的管状组织形态、细胞活性及胞外基质分布等组织特性的影响。结果表明：通过自然沉降的方式装填微组织,可以构建结构完整、机械和压缩性能良好的管状组织。但灌注过程中部分微组织易散落,破坏构建物整体结构。不同微组织初始堆积密度影响堆积物中空隙率,与初始堆积密度为22g/cm3、44g/cm3的管状组织相比,微组织初始堆积密度为30g/cm3时形成的管状组织外形完整、微组织之间结合紧密,管状组织各区域细胞活性较高,胞外基质含量多且分布较均匀。与灌注培养时间为10d、23d的实验组相比,灌注培养时间为14d时构建的管状组织,其细胞活性和胞外基质含量在内外侧区域较高,中间区域稍低,但都高于培养10d及23d的组织,且在内外侧区域出现较厚的致密层。而培养时间为10d时构建的管状组织组织结构松散;培养时间延长至23d时构建的管状组织中各区域呈现明显的细胞活性和胞外基质分布不均匀现象。综上所述,采用微构重塑技术,在灌注培养阶段,通过优化微组织装填方式和灌注培养时间等参数,可以获得机械性能较好、结构完整、细胞和ECM分布均匀的管状组

关键词：血管化微组织灌注培养管状组织堆积密度

基于图案化表面和微组织的肌功能成熟与评价体系构建

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基于图案化表面和微组织的肌功能成熟与评价体系构建

作者：王钢湖北大学

学位级别：硕士

动物的运动能力是由肌肉系统实现的。在脊椎动物中,主要有三类肌肉系统,分别是骨骼肌、心肌和平滑肌。肌肉组织是高度有序的收缩装置,肌肉组织的有序排列是产生收缩功能的必要条件。在生物体内,肌肉组织在宏观组织层面和微观细胞器以及... 详细信息

动物的运动能力是由肌肉系统实现的。在脊椎动物中,主要有三类肌肉系统,分别是骨骼肌、心肌和平滑肌。肌肉组织是高度有序的收缩装置,肌肉组织的有序排列是产生收缩功能的必要条件。在生物体内,肌肉组织在宏观组织层面和微观细胞器以及分子蛋白层面都是高度有序排列的结构。在骨骼肌中,大量有序排列的肌纤维形成肌束,大量的肌束同向排列,形成宏观的骨骼肌组织;在心脏中,心肌由合胞体组成,单个细胞通过闰盘相互连接,形成分支状,在机械结构和电生理上形成整体;平滑肌存在于中空管腔内部,也具有高度取向排列的特点。在血管内部,平滑肌呈长梭形,按照一定的螺旋角度分布。在肌细胞内部,粗肌丝、细肌丝、线粒体其他细胞骨架的有序排列,是肌细胞产生收缩力的基础条件。我们体外研究肌肉组织时,同样需要使肌肉细胞按照同向的角度排列,有序排列的肌肉组织可以产生同步、同向的收缩,使单个细胞的收缩力和收缩距离协同作用,在组织器官层面体现出宏观的组织运动。现在有多种方法可以实现肌细胞的取向排列。在细胞平面培养时,使用图案化表面可以控制细胞的生长方向。在肌细胞培养时,一般使用条纹状的表面,实现肌细胞的定向生长。在组织培养中,由于组织内部的张力,肌细胞也被拉长,取向生长。本研究中我们的两位病人患有心血管系统遗传疾病,通过外显子测序发现,两位病人分别在DSP和FBN1基因上存在致病突变,分别导致心肌细胞和平滑肌细胞的异常。通过体细胞重编程技术,我们得到了病人基因型特异性的干细胞系。通过i PSC体外诱导分化,我们分别得到平滑肌细胞和心肌细胞。在我们构建的平面和3D组织培养体系中,可以检测到突变型和野生型心肌细胞和平滑肌细胞的结构和功能差异。

关键词：细胞结构图案化表面微组织心肌细胞平滑肌细胞马凡综合征 3D微组织诱导多能干细胞肌肉细胞

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微组织教学模式实施设计

发明与创新（初中生） 2021年第5期 188-189页

作者：戚文革吉林电子信息职业技术学院吉林吉林132021

微组织教学模式实施设计中,要满足"一点一讲一练一确认""学习过程、学习结果可视化""教学三角结构完整实施"三个要求。因此,教学内容设计中教学单元最小化成为必然,教学内容是教学实施的基础,即时反馈既是"教""也是学""更是评"。因此,... 详细信息

微组织教学模式实施设计中,要满足"一点一讲一练一确认""学习过程、学习结果可视化""教学三角结构完整实施"三个要求。因此,教学内容设计中教学单元最小化成为必然,教学内容是教学实施的基础,即时反馈既是"教""也是学""更是评"。因此,教学实施设计不是孤立的,教学内容、教学实施、教学评价三者密不可分,构成了三位一体的整体教学设计。

关键词：微组织教学模式教学实施设计

心肌微组织的构建及其在心肌损伤修复中的研究进展

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中华细胞与干细胞杂志（电子版） 2022年第4期12卷 224-229页

作者：柯敏霞杨黄恬中国科学院中国科学院大学上海营养与健康研究所肿瘤与微环境重点实验室分子心脏学研究组上海200031

心肌梗死(MI)及其导致的心力衰竭(HF)是疾病致死的主要原因,严重威胁人类健康。现有药物和介入治疗手段无法补偿MI引起的心肌细胞丢失这一导致HF的关键病理性改变。随着干细胞生物学、材料科学和工程技术的进展和整合,心肌微组织(CMTs)... 详细信息

心肌梗死(MI)及其导致的心力衰竭(HF)是疾病致死的主要原因,严重威胁人类健康。现有药物和介入治疗手段无法补偿MI引起的心肌细胞丢失这一导致HF的关键病理性改变。随着干细胞生物学、材料科学和工程技术的进展和整合,心肌微组织(CMTs)构建的探索成为心脏再生医学研究领域的新生长点。本文回顾CMTs构建的研究进展及对MI后损伤修复的作用,重点讨论CMTs的构建策略、在MI后心肌损伤修复中的移植方式和效果,并探讨CMTs用于缺血性心肌损伤修复需解决的问题。

关键词：心肌梗死多能干细胞心肌细胞微组织