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异种脱细胞真皮基质微粒皮肤的构建及其相关实验研究

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异种脱细胞真皮基质微粒皮肤的构建及其相关实验研究

作者：汪海轮第四军医大学

学位级别：硕士

深度缺损创面的修复在烧烫伤、难治性皮肤溃疡、瘢痕整形等的治疗中有着重要意义。传统的治疗方法主要是移植自体皮或自体皮瓣,常常会出现供皮区色素沉积,瘢痕形成。当皮肤缺损面积较大时,自体皮还会供应不足。皮肤组织工程(TE)的发展... 详细信息

深度缺损创面的修复在烧烫伤、难治性皮肤溃疡、瘢痕整形等的治疗中有着重要意义。传统的治疗方法主要是移植自体皮或自体皮瓣,常常会出现供皮区色素沉积,瘢痕形成。当皮肤缺损面积较大时,自体皮还会供应不足。皮肤组织工程(TE)的发展与应用为改善创面修复质量,解决皮源短缺问题,提供了一条崭新的途径。近年来,脱细胞真皮基质(ADM)成为组织工程皮肤研究中最有前景的真皮支架材料之一,ADM修复皮肤粘膜缺损和进行软组织充填的有效性已经被动物实验和初期临床应用实验所证明,是一种较为理想的真皮替代物。由于同种异体ADM来源有限且受伦理限制,为此研究人员开发了猪的ADM。传统方法制备的异种ADM,抗原性明显强于同种异体ADM,移植后成活率降低且收缩明显,组织学研究证实组织中有广泛的炎症反应及胶原结构破坏。目前,异种ADM的制备方法还缺乏统一标准,主要有高渗盐水法、酶消化法、戊二醛交联法、去垢剂法、NaOH消蚀法、冻融法等。每种方法单独使用时都不能保证既充分去除所有的细胞和细胞碎片,又保证真皮结构完整,必须与其他方法联合应用方能获得较理想的ADM支架材料。另一方面,ADM移植后的血管化及营养成分渗透等问题的解决,对提高ADM支架的实用性有着重要的临床意义。本课题在现有ADM制备方法的基础上,制备一种新型异种ADM微粒,并利用成纤维细胞能够分泌多种细胞外基质、细胞因子和生长因子的特性,将成纤维细胞种植于异种ADM微粒上,探索构建ADM微粒皮肤的可行性;并将ADM微粒皮肤注射到SD大鼠皮下和移植到全层损伤模型,观察ADM微粒皮肤对软组织和创伤的修复能力,期望能够收获一种应用方便,适用范围广的组织工程微粒皮肤产品,并为规模化、商品化生产微粒皮肤奠定一个良好的基础。本实验的研究内容和结果如下: 1.改良消蚀法制备异种脱细胞真皮基质微粒及其生物相容性评价应用机械法切除猪真皮乳头层,结合胰酶消化、NaOH消蚀法和冻融法除去网状真皮中的所有细胞,制备成ADM。将ADM切割成颗粒状,对ADM微粒做细胞毒性实验、细胞相容性实验、皮下埋藏实验和免疫组化实验检验其生物相容性。结果显示ADM微粒大小较均匀呈瓷白色,有弹性,韧性好,质地柔软;三维结构完整,胶原纤维稍松散但排列规则,相互交织成立体网状结构,孔隙较多并均匀;成纤维细胞在ADM微粒上生长较好,在材料上有数层细胞生长;无明显排异反应,组织相容性良好,血管和成纤维细胞长入快。 2.异种ADM微粒皮肤的构建及其性能研究体外培养人成纤维细胞,用PKH26标记,将细胞与ADM微粒复合构建微粒皮肤,用荧光显微镜观察、电镜观察和MTT法检测组织工程微粒皮肤的性能。结果显示,种植第2天,成纤维细胞在ADM微粒上能够较好黏附,但增殖缓慢,之后细胞增殖明显加快,10天时达到增殖高峰。成纤维细胞能在ADM微粒上很好的生长,构建好的组织工程微粒皮肤上成纤维细胞呈多层生长,并分泌大量细胞外基质。 3.异种ADM微粒皮肤皮下注射和SD大鼠全层皮肤损伤移植实验将带荧光的猪ADM微粒皮肤,注射到SD大鼠皮下,用荧光显微镜和HE观察ADM微粒真皮对皮下组织的修复;将SD大鼠随机分成3组,分别移植自体全厚皮肤、ADM微粒和ADM微粒皮皮肤。大体、荧光显微镜和HE观察伤口愈合情况、计算创面愈合时间和收缩率。结果显示ADM微粒皮下注射后一周可观察到红色荧光,提示种植的成纤维细胞具有活性。皮下注射ADM微粒皮肤8周时体积稳定,胶原排列整齐,成纤维细胞数目少并稳定,而单纯ADM微粒皮下注射12周时体积才稳定。皮肤移植修复全层皮肤损伤模型见:ADM微粒皮肤移植和ADM微粒移植相比,血管化加快,特别是移植早期;ADM微粒皮肤对创面的修复,其愈合时间与自体全厚皮肤移植相当(P﹥0.05),明显好于单纯ADM微粒移植(P﹤0.01);创面收缩情况,ADM微粒皮肤与自体全厚皮肤移植相比无统计学意义(P﹥0.05),与ADM微粒移植相比,差异显著(P﹤0.01)。综上所述,我们所制备的猪ADM微粒是一种新型、免疫原性低、生物相容性好的真皮支架材料,用于构建微粒皮肤具有实际可行性。体内动物实验表明这种ADM微粒通过皮下注射或创面移植均可有效促进创面愈合,修复缺损。有望在将来成为一种新型治疗途径扩展组织工程皮肤替代物的应用前景。

关键词：组织工程(TE) 微粒皮肤脱细胞真皮基质(ADM) 成纤维细胞生物相容性皮下注射移植

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微粒皮肤移植后的病理形态观察

中华烧伤杂志 1988年第4期 286-287+320+324页

作者：韩巽张明良陈伟乐北京市创伤骨科研究所烧伤科北京积水潭医院病理科

大面积皮肤烧伤因患者自体供皮区少,需皮量大,临床治疗困难。张明良等用微粒皮肤移植法取得满意效果。受皮区与供皮区面积比为10:1时,30天可完全愈合;比例如大到15:1时,45天仍可完全愈合。此法能大大减少自体皮需要量,对大面积烧伤的治... 详细信息

大面积皮肤烧伤因患者自体供皮区少,需皮量大,临床治疗困难。张明良等用微粒皮肤移植法取得满意效果。受皮区与供皮区面积比为10:1时,30天可完全愈合;比例如大到15:1时,45天仍可完全愈合。此法能大大减少自体皮需要量,对大面积烧伤的治疗有重要意义。本

关键词：微粒皮肤病理

微粒皮肤移植治疗特大面积烧伤（附7例报告）

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临沂医学专科学校学报 1994年第2期16卷 125-126页

作者：马东顺蒋伟栋胡振旭王玉现临沂地区人民医院烧伤科沂南县人民医院外科

报告应用微粒皮肤移植技术抢救成功７例特大面积烧伤病人。文中介绍了手术方法、注意事项，指出了本术式的优缺点，并对该领域国内外的发展状况，作了简单叙述。

关键词：微粒皮肤皮肤移植烧伤

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微粒皮肤移植术64例的临床应用

包头医学 1995年第3期19卷 1-3页

作者：王凌峰张烨峰巴特包钢职工医院

本文通过对６４例次严重烧伤病人进行微粒皮肤移植术的总结，提出了该方法对大面积烧伤治疗的优越性，特别是对面积超过５０％的病人。本组病例中７０．０７％的部位异体皮排斥后微粒自体皮已将创面修复，不需再次植皮。本文指出对深度... 详细信息

本文通过对６４例次严重烧伤病人进行微粒皮肤移植术的总结，提出了该方法对大面积烧伤治疗的优越性，特别是对面积超过５０％的病人。本组病例中７０．０７％的部位异体皮排斥后微粒自体皮已将创面修复，不需再次植皮。本文指出对深度烧伤不论是早期还是后期溶痂后形成的肉芽创面，均可进行微粒皮移植，在肉芽创面上进行微粒皮肤移植也可取得较好效果，另外还提出了该方法的病例选择问题。

关键词：微粒皮肤移植

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微粒皮肤移植术在烧伤创面修复中的应用

中华整形烧伤外科杂志 1990年第4期6卷 275-277页

作者：谢卫国李济时武汉市第三医院烧伤科邮政编码430060

关键词：烧伤创面修复皮肤移植微粒皮肤

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组织工程微粒皮肤的构建及其性能研究

生物医学工程与临床 2008年第3期12卷 171-174,F0002页

作者：汪海轮吕咸余春艳冯雅琴冯枫张勇杰黄沙邓天政张锐红金岩第四军医大学唐都医院皮肤科 93942部队医院第四军医大学组织工程研发中心

目的探索利用人成纤维细胞和York猪脱细胞真皮基质(ADM)微粒复合构建组织工程微粒皮肤的可行性并对其进行初步研究。方法体外培养取自胎背的人成纤维细胞,用PKH26标记,将细胞与ADM微粒复合构建微粒皮肤,用荧光显微镜观察、电镜观察和MT... 详细信息

目的探索利用人成纤维细胞和York猪脱细胞真皮基质(ADM)微粒复合构建组织工程微粒皮肤的可行性并对其进行初步研究。方法体外培养取自胎背的人成纤维细胞,用PKH26标记,将细胞与ADM微粒复合构建微粒皮肤,用荧光显微镜观察、电镜观察和MTT法检测组织工程微粒皮肤的性能。结果脱细胞真皮基质微粒均匀柔软,弹性、韧性好,三维结构完整且排列规则。细胞与ADM微粒的复合情况良好,2h后开始黏附,2d后增殖明显,10d增殖达到高峰;7d时取材,HE和SEM显示成纤维细胞在ADM微粒表面成层黏附,并分泌大量基质;细胞生长良好。结论利用人成纤维细胞和York猪的ADM微粒可以构建具有活性的组织工程微粒皮肤。

关键词：组织工程微粒皮肤脱细胞真皮基质成纤维细胞

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