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苹果茎沟病毒微滴数字RT-pcr检测方法的建立和应用

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植物病理学报 2024年第2期54卷 436-442页

作者：王岩滨安玮李殷吴云锋郝兴安西北农林科技大学植物保护学院杨凌712100

我国是第一大苹果生产国。苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)在我国各苹果产区分布广泛,侵染果树导致树势变弱,生长量减少,果实品质下降,严重威胁我国苹果产业的可持续发展。病毒检测是果树病毒病防控的重要前提。本研究根... 详细信息

我国是第一大苹果生产国。苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)在我国各苹果产区分布广泛,侵染果树导致树势变弱,生长量减少,果实品质下降,严重威胁我国苹果产业的可持续发展。病毒检测是果树病毒病防控的重要前提。本研究根据苹果茎沟病毒外壳蛋白基因保守序列,设计了引物和探针,建立了微滴数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)检测方法。所建立的检测方法能特异性检出苹果茎沟病毒,检测重复性好,灵敏度比qRT-pcr法高10倍,可适用于田间样品及组培苗检测。该方法的建立为苹果茎沟病毒的检测提供了重要的技术手段。

关键词：苹果茎沟病毒微滴数字pcr 检测

利用微滴数字pcr仪定量检测贝类中两种弧菌方法的建立

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现代科学仪器 2024年第1期41卷 48-53页

作者：聂丹丹丁旭姜佳颖于淼淼李爱军李玲罗雁非长春海关技术中心长春130062 长春海关保健中心长春130062

建立贝类中霍乱弧菌和副溶血性弧菌微滴数字聚合酶链式反应快速精准定量检测方法,评价其可行性。采用SN/T 2425-2010和SN/T 2424-2010的引物和探针,建立双重微滴数字pcr反应体系。霍乱弧菌和副溶血性弧菌双重微滴数字pcr的最低检测限度... 详细信息

建立贝类中霍乱弧菌和副溶血性弧菌微滴数字聚合酶链式反应快速精准定量检测方法,评价其可行性。采用SN/T 2425-2010和SN/T 2424-2010的引物和探针,建立双重微滴数字pcr反应体系。霍乱弧菌和副溶血性弧菌双重微滴数字pcr的最低检测限度分别可达到2.9 copies/μL和1.7 copies/μL,相当于1×10^(5)CFU/mL纯菌液,所建立的双重微滴数字pcr检测方法具有特异性和灵敏性,重复性试验结果也很稳定,不与其他常见病原菌发生交叉反应。本研究建立的双重微滴数字pcr方法可有效定量检测贝类样品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌。

关键词：微滴数字pcr 霍乱弧菌副溶血性弧菌定量检测

基于国产微滴数字pcr的SNP快速检测技术研究

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生物化学与生物物理进展 2022年第6期49卷 1123-1134页

作者：林培双王寒祝令香贝蕾黄江赵雯婷李彩霞贵州医科大学法医学院贵阳550004 公安部物证鉴定中心法医遗传学公安部重点实验室现场物证溯源技术国家工程实验室北京100038 新羿制造科技有限公司北京100038

目的在法医学领域,现有的SNP检测主要依赖进口,检测工作量大、耗时长且成本较高。微滴数字pcr (droplet digital pcr,ddpcr)作为新一代的pcr技术,可以快速检测低浓度样本DNA,且有较强的抗干扰能力。本研究旨在国产ddpcr平台建立SNP分... 详细信息

目的在法医学领域,现有的SNP检测主要依赖进口,检测工作量大、耗时长且成本较高。微滴数字pcr (droplet digital pcr,ddpcr)作为新一代的pcr技术,可以快速检测低浓度样本DNA,且有较强的抗干扰能力。本研究旨在国产ddpcr平台建立SNP分型检测体系并对其性能进行评估,以探讨ddpcr技术在法医学检验领域的应用价值。方法在ddpcr平台建立高原适应性EPAS1单倍型(rs115321619、rs73926263、rs73926264、rs73926265和rs55981512)检测体系,测试各位点引物探针特异性,对体系的准确性、稳定性、灵敏度、检材适应性进行评估,并比较了ddpcr和SNaPshot微测序检测体系的抗抑制性,最后对样本地区来源进行测试。结果 ddpcr在2.5 h内即可快速获取检测结果,体系准确性和稳定性好,检测灵敏度为0.312 5 ng,且抗抑制性能力突出。70份测试样本检测结果与背景信息一致。结论基于ddpcr的SNP检测体系具有准确可靠、简便快速、抗抑制能力强等优势,在法医学快速检验领域有较强的应用潜力,适合法医现场检验需求。

关键词：微滴数字pcr 法医学检验 SNP分型

利用微滴数字pcr技术分析转基因大豆‘GE-J12’中外源基因的拷贝数

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中国农业大学学报 2022年第1期27卷 58-66页

作者：赵新刘双刘娜李瑞环曹英芳兰青阔王永天津市农业科学院生物技术研究所天津300384 河北农业大学食品科技学院河北保定071001

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计pcr扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lecti... 详细信息

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计pcr扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字pcr拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字pcr检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。

关键词：拷贝数微滴数字pcr 转基因大豆外源基因

猪急性腹泻综合征冠状病毒微滴数字pcr技术的建立和应用

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病毒学报 2023年第5期39卷 1385-1394页

作者：陈可欣曾若雪裘慧金晨晨陈小金董志珍宋厚辉张晓峰帅江冰浙江农林大学动物科技学院·动物医学院杭州311300 浙江省检验检疫科学技术研究院杭州310016 天津海关动植物与食品检测技术天津300461

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)是近年来在我国新发现的一种会引起猪严重腹泻的冠状病毒,本文旨在建立一种特异性强、重复性好、灵敏度高的SADS-CoV微滴式数字聚合酶链式反应(Digital d... 详细信息

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)是近年来在我国新发现的一种会引起猪严重腹泻的冠状病毒,本文旨在建立一种特异性强、重复性好、灵敏度高的SADS-CoV微滴式数字聚合酶链式反应(Digital droplet pcr,ddpcr)检测方法。采用SADS-CoV的N基因作为本研究的靶基因,根据其基因序列设计特异性引物及探针。通过优化反应体系中的反应条件,分析方法特异性、敏感性和稳定性,并对临床样本和猪源产制品进行检测验证,建立了猪急性腹泻综合征冠状病毒微滴数字pcr体系。本方法确定最佳引物浓度为500 nmol/L,最佳探针浓度为250 nmol/L,且在58℃反应条件下,ddpcr检测结果最优。本方法与其他常见猪源性病毒无交叉反应,特异性强;本方法重复性好,批间与批内变异系数均小于10%。本ddpcr方法在动态范围内最低检测限为3.85拷贝/反应,比荧光定量pcr(qpcr)高10倍以上。采用qpcr和ddpcr分别对90份样品进行检测,ddpcr方法阳性检出率为13.33%(12/90)优于qpcr阳性检出率11.11%(10/90)。本文首次建立了单重SADS-CoV ddpcr检测方法,其有更优的可靠性以及抗干扰性,为定量检测动物组织、饲料、血清和粪便等样品中SADS-CoV提供了新的、稳定的技术手段。

关键词：猪急性腹泻综合征冠状病毒微滴数字pcr 定量检测方法

貂肠炎病毒微滴数字pcr检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2023年第2期53卷 156-162页

作者：商金源叶京飞罗国良王振军冯二凯王春霞贾北宁李斌茹赵宗正陈明军魏先力程悦宁中国农业科学院特产研究所农业部经济动物疫病重点实验室吉林长春130122 辽宁省葫芦岛市南票区农业发展服务中心辽宁葫芦岛125027 刘台庄畜牧兽医中心站河北秦皇岛066600 军事科学院军事兽医研究所吉林长春130112 吉林省榆树市秀水镇畜牧站吉林榆树130436

建立一种貂肠炎病毒(MEV)微滴数字pcr(ddpcr)方法,对貂肠炎病毒的定量诊断提供技术支持。在实时荧光定量pcr(qpcr)检测方法的基础上,建立了貂肠炎病毒微滴数字pcr方法,优化了该检测方法的反应条件,并评估了其敏感性、特异性、重复性。... 详细信息

建立一种貂肠炎病毒(MEV)微滴数字pcr(ddpcr)方法,对貂肠炎病毒的定量诊断提供技术支持。在实时荧光定量pcr(qpcr)检测方法的基础上,建立了貂肠炎病毒微滴数字pcr方法,优化了该检测方法的反应条件,并评估了其敏感性、特异性、重复性。结果显示,建立的ddpcr方法最佳引物和探针终浓度分别为900和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃,最佳升降温速度为2.5℃/s,本方法的最低检测下限为1.07×10^(0)copies/μL,未发现与常见疫病病毒存在交叉反应,重复性试验的变异系数小于5%。采用该微滴数字pcr和实时荧光pcr对40份水貂肠道、粪便样品进行检测,检测结果与临床检验结果相符。结果表明,本研究中建立的微滴数字pcr方法敏感性高、特异性强、重复性好,适用于临床样品的貂肠炎病毒核酸检测,为貂肠炎病毒感染的早期检测提供了技术支持。

关键词：貂肠炎病毒微滴数字pcr 定量检测

微滴数字pcr定量检测葡萄膜黑色素瘤患者GNAQ/11突变基因

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四川大学学报（医学版） 2020年第4期51卷 521-525页

作者：赵清陈莹莹侯宸曾少雪张宇辉张军军四川大学华西临床医学院四川大学华西医院眼科成都610041 四川大学华西临床医学院循证医学教研室成都610041

目的探讨基于微滴数字pcr定量检测葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)患者肿瘤组织GNAQ/11突变的可行性。方法肿瘤标本取自2009-2015年间在四川大学华西医院确诊并行眼球摘除术的78例UM患者的甲醛固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织,取标本前... 详细信息

目的探讨基于微滴数字pcr定量检测葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)患者肿瘤组织GNAQ/11突变的可行性。方法肿瘤标本取自2009-2015年间在四川大学华西医院确诊并行眼球摘除术的78例UM患者的甲醛固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织,取标本前所有患者均未进行放疗或化疗。采用回顾性研究,以微滴数字pcr技术检测葡萄膜黑色素瘤GNAQ/11的突变情况,同时Sanger测序对目标基因进行DNA测序,比较两种检测方式结果的一致性。结果74例UM患者肿瘤组织GNAQ/11突变频率为91.9%。对Sanger测序与微滴数字pcr技术两种方式检测74例葡萄膜黑色素瘤患者GNAQ/11突变的结果进行一致性检验,Kappa系数=0.436,P=0.001。检测GNAQ/11突变基因的两种方法差异最常见的是Sanger测序没有检测出GNAQ/11突变。Sanger测序结果的出错率在异质突变组高于同质突变组(12/37 vs.3/16,P=0.53),但差异无统计学意义。结论微滴数字pcr与Sanger测序结果具有较好的一致性,葡萄膜黑色素瘤中GNAQ/11的突变率差异较大。数字pcr检测葡萄膜黑色素瘤患者GNAQ/11突变频率接近报道水平。肿瘤组织DNA来源于FFPE的样本更推荐使用灵敏度高的微滴数字pcr检测基因突变,Sanger测序易出现假阴性结果。

关键词：葡萄膜黑色素瘤 GNAQ/11 微滴数字pcr Sanger测序

HSA转基因水稻二重微滴数字pcr定量检测方法研究

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中国油料作物学报 2022年第5期44卷 1098-1107页

作者：李晓飞姚晓青闫晓红李俊朱莉吴刚罗军玲中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室湖北武汉430062

重组人血清白蛋白(HSA,Human serum albumin)基因工程水稻是我国自主研发的可规模化生产水稻重组人血清白蛋白(OsrHSA)的转基因品系,具有极高的推广价值和应用前景,但是目前缺乏对其进行精准定量检测的方法。微滴数字pcr(ddpcr,droplet ... 详细信息

重组人血清白蛋白(HSA,Human serum albumin)基因工程水稻是我国自主研发的可规模化生产水稻重组人血清白蛋白(OsrHSA)的转基因品系,具有极高的推广价值和应用前景,但是目前缺乏对其进行精准定量检测的方法。微滴数字pcr(ddpcr,droplet digital pcr)是近年来新兴的前沿pcr技术,不依赖标准物质即可实现对DNA分子的绝对定量,在转基因产品定量领域被广泛应用。本研究基于ddpcr平台建立了适用于重组人血清白蛋白基因工程水稻(114-7-2品系)的二重ddpcr精准定量检测方法。通过对引物探针的特异性进行验证、对引物探针工作浓度和反应退火温度进行优化,获得最佳反应条件。进而对该方法检测限、定量限和结果重复性做了测定。最后通过对不同含量的重组人血清白蛋白转基因水稻样品进行定量检测,分析比较传统实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr,qRT-pcr)和二重ddpcr的优劣,结果表明本研究建立的转基因水稻HSA/PLD二重ddpcr方法稳定性更好、灵敏度高、成本低廉,精准可靠,适用于不依赖标准物质的精准定量HSA转基因水稻转化体含量分析,可取代qRT-pcr方法进行HSA转基因水稻的绝对定量检测,完善了我国转基因水稻成分精确定量检测技术体系。

关键词：基因工程水稻水稻重组人血清白蛋白(OsrHSA) 微滴数字pcr 绝对定量转基因

水貂犬瘟热病毒微滴数字pcr检测方法的建立与应用

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中国兽医学报 2023年第12期43卷 2445-2450页

作者：闫曼平商金源叶京飞罗国良王振军易立冯二凯王春霞赵宗正陈明军魏先力高华单晓枫程悦宁中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室吉林长春130122 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 军事科学院军事兽医研究所吉林长春130112 吉林省榆树市秀水镇畜牧站吉林榆树130436 通辽市科尔沁区动物疫病预防控制中心内蒙古通辽028000

为建立检测水貂犬瘟热病毒(mink canine distemper virus,CDV)的微滴数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)定量方法,以便提供水貂CDV在诊断检测方面的技术支持,本研究根据实时荧光定量pcr(real-time quantitative pcr,qpcr)检测方法原理,建立了水貂CDV数字pcr方法,并优化了反应条件,评估了特异性、敏感性以及重复性。结果表明:ddpcr方法检测CDV的最适引物浓度为900 nmol/L,探针浓度为250 nmol/L,退火温度为55℃,升降温度为2.5℃/s,最低检测下限为4.4拷贝/μL;除CDV特异性扩增,其他常见病毒特异性检测结果均为阴性;重复性试验的变异系数均小于5%。采用该微滴数字pcr和荧光定量RT-pcr方法对30份犬、貂、狐、貉等组织(其中CDV阳性样品7份)样品进行检测,检测结果与临床检测结果相符。本研究建立的微滴数字pcr方法对CDV定量检测特异性强、灵敏度高,重复性好,可以用于水貂CDV临床样品的核酸检测,对水貂CDV发病早期的诊断提供新的定量检测方法。

关键词：水貂犬瘟热病毒微滴数字pcr N基因