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腺病毒介导的shRNA下调PTEN表达对活化肝星状细胞微丝结合蛋白vinculin、filamin A及cortactin的影响

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中华肝脏病杂志 2022年第1期30卷 38-44页

作者：郝礼森宋洁张明婷宋小杰蒋美钰季景秀莫艳波王静华北理工大学附属医院消化内科唐山063000 张家口市第一医院张家口075000 沧州市人民医院沧州061000

目的探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对活化肝星状细胞(HSC)的纽蛋白(vinculin)、细丝蛋白A(filamin A)及皮层肌动蛋白(cortactin)的影响。方法体外培养活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,将... 详细信息

目的探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对活化肝星状细胞(HSC)的纽蛋白(vinculin)、细丝蛋白A(filamin A)及皮层肌动蛋白(cortactin)的影响。方法体外培养活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,将携带靶向PTEN的RNA干扰序列[短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)]的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN及对照空病毒Ad-GFP转染HSC;采用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测各组HSC的PTEN mRNA及蛋白表达;借助激光扫描共聚焦显微镜,采用免疫荧光法检测各组HSC的vinculin、filamin A及cortactin表达变化,并利用Image-pro plus 6.0软件进行图像分析处理,计算所测蛋白荧光表达的积分光密度值(IOD)。实验分为3组:对照组(在腺病毒转染步骤以DMEM代替腺病毒液)、Ad-GFP组(转染仅表达绿色荧光蛋白的空病毒Ad-GFP)、Ad-shRNA/PTEN组(转染携带靶向PTEN的shRNA并表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN)。3组间均数比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验。结果靶向PTEN的shRNA成功转染并显著下调HSC的PTEN mRNA及蛋白表达(P0.05)。3组HSC的filamin A荧光IOD差异无统计学意义(P>0.05),但3组HSC的filamin A亚细胞分布发生了变化,Ad-shRNA/PTEN组HSC的filamin A主要分布于细胞质,而对照组和Ad-GFP组HSC的filamin A主要位于细胞核,Ad-shRNA/PTEN组HSC的filamin A核质比(0.60±0.15)明显低于对照组(1.20±0.15)及Ad-GFP组(1.08±0.23),P0.05)。3组HSC的cortactin主要分布于细胞质,Ad-shRNA/PTEN组HSC的cortactin荧光IOD(54688.50±2095.53)较对照组(22959.94±1710.42)及Ad-GFP组(22547.11±1588.72)显著升高(P0.05)。结论PTEN表达下调使体外活化肝星状细胞的微丝结合蛋白vinculin及cortactin的表达上调,并使另一微丝结合蛋白filamin A的亚细胞分布发生改变即出现胞核向细胞质转位。

关键词：星状细胞细丝蛋白A 微丝结合蛋白纽蛋白皮层肌动蛋白

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植物特有微丝结合蛋白研究进展

中国科学：生命科学 2017年第8期47卷 829-838页

作者：钱东向云兰州大学生命科学学院细胞活动与逆境适应教育部重点实验室兰州730000

微丝骨架存在于所有真核生物,并且参与了诸多重要的细胞生物学过程和生理活动.微丝骨架在不同的细胞类型和生物学过程中呈现出各自特异的结构和动态变化模式,此过程由许多不同生化特性的微丝结合蛋白(ABPs)家族成员直接调控.不同真核生... 详细信息

微丝骨架存在于所有真核生物,并且参与了诸多重要的细胞生物学过程和生理活动.微丝骨架在不同的细胞类型和生物学过程中呈现出各自特异的结构和动态变化模式,此过程由许多不同生化特性的微丝结合蛋白(ABPs)家族成员直接调控.不同真核生物的肌动蛋白(actin)都具有较高的同源性和相似的调控过程,但是由于动物和植物在某些特定的组织结构、生理特性等方面存在本质上的不同,进而导致动植物的微丝动态调控机制存在一定差异.ABPs和actin存在共进化的关系,由此许多动物和植物的ABPs也相应地产生了差异.例如,许多哺乳动物和酵母中保守的ABPs在植物基因组中不存在;一系列植物特有的ABPs被相继发现;部分哺乳动物中保守的ABPs成员或一些非ABPs在植物中也演化出了新的生化特性和微丝调控活性.本文概述了目前已发现的植物特有ABPs及其生化特性和生理学功能,归纳了植物中探究新ABPs的研究思路和方法,并对未来植物微丝骨架的研究方向和可能的研究热点进行了展望.

关键词：微丝骨架微丝结合蛋白功能结构域植物特有调控机制

树突状细胞分化过程中部分微丝结合蛋白表达差异

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基因组学与应用生物学 2020年第12期39卷 5844-5850页

作者：王佳邱炜叶远浓胡祖权王赟曾柱贵州医科大学生物与工程学院贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心贵州医科大学生物与医学工程重点实验室贵阳550025 贵州医科大学基础医学院贵阳550025

通过研究树突状细胞(dendritic cells,DCs)分化过程中部分微丝结合蛋白的表达差异,以期进一步深入理解DCs的生物学行为并为DCs疫苗的临床应用提供理论依据。从人外周血中分离出单核细胞(monocytes,MOs),经细胞因子诱导获得未成熟树突状... 详细信息

通过研究树突状细胞(dendritic cells,DCs)分化过程中部分微丝结合蛋白的表达差异,以期进一步深入理解DCs的生物学行为并为DCs疫苗的临床应用提供理论依据。从人外周血中分离出单核细胞(monocytes,MOs),经细胞因子诱导获得未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs)和成熟树突状细胞(mature dendritic cells,m DCs)。利用蛋白免疫印迹法检测MOs、imDCs和m DCs中部分微丝结合蛋白的表达水平,然后联合逐步回归分析和主成分分析在这些微丝结合蛋白中筛选出起关键作用的蛋白。DCs分化过程中,Arp2/3复合体、caldesmon、gelsolin、WASP、WAVE 1、fascin、filamin A、α-actinin和Cap Z的表达水平均发生了不同程度的上调,formin的表达水平发生下调,profilin和VASP的表达水平没有明显变化。联合逐步回归分析和主成分分析发现,在这些微丝结合蛋白中,Cap Z可能在DCs分化过程中起关键作用。DCs分化过程中部分微丝结合蛋白的表达发生了明显变化,可能与其形态和免疫学功能的变化密切相关,这对深入理解DCs的生物学行为来说具有重要意义。

关键词：树突状细胞微丝结合蛋白分化逐步回归分析主成分分析

植物新的微丝结合蛋白PGSL1的鉴定及功能研究

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植物新的微丝结合蛋白PGSL1的鉴定及功能研究

作者：韩亚希兰州大学

学位级别：硕士

微丝骨架在被子植物花粉萌发和花粉管生长过程中起着关键性的作用。微丝骨架的结构和动态变化直接受不同功能的微丝结合蛋白(Actin-Binding Protein,ABP)调控。目前,已报道了一些与花粉萌发和花粉管生长密切相关的ABPs,它们在花粉萌发... 详细信息

微丝骨架在被子植物花粉萌发和花粉管生长过程中起着关键性的作用。微丝骨架的结构和动态变化直接受不同功能的微丝结合蛋白(Actin-Binding Protein,ABP)调控。目前,已报道了一些与花粉萌发和花粉管生长密切相关的ABPs,它们在花粉萌发和花粉管生长过程中发挥着不同的功能,通过调控微丝解聚、聚合、成束、交联等过程,共同维持着花粉管内微丝骨架的精细结构和动态平衡。然而,目前关于微丝骨架在调控花粉萌发和花粉管生长的分子机制的研究还不够完善,仍需鉴定和挖掘一些新的、植物特异的ABPs。因此,本论文通过正向遗传学方法,从EMS诱变的拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体植株中筛选出花粉萌发对微丝解聚药物Latrunculin B(Lat B)敏感的突变体(Pollen Germination Sensitive to Lat B,pgsl),并主要研究了命名为pgsl1-1的突变体,初步探索了与表型相关的目的基因、亚细胞定位以及PGSL1调控微丝骨架和花粉管极性生长的分子机制,并获得了如下研究结果:1.通过正向遗传学筛选拟南芥花粉萌发对微丝解聚药物LatB敏感突变体,获得了突变体pgsl1-1,其花粉萌发和花粉管生长对微丝解聚药物LatB非常敏感。2.利用全基因组重测序的集群分离关联分析技术鉴定得到pgsl1-1是由于PGSL1基因提前终止产生,PGSL1是一个植物特有的功能未知基因;表型观察发现PGSL1的等位T-DNA插入功能缺失突变体pgsl1-2也表现出花粉萌发和花粉管生长对Lat B敏感的表型,并且PGSL1可以回补pgsl1-1突变体花粉萌发对Lat B敏感的表型。这表明pgsl1-1突变体花粉萌发对Lat B敏感的表型确实是由于PGSL1功能缺失造成的。3.组织化学染色和qRT-PCR分析发现PGSL1主要在成熟花粉和花粉管中表达;利用融合荧光蛋白技术分析发现GFP-PGSL1在花粉管胞质中分布,并在花粉管顶端聚集分布。4.通过体外生化分析发现,PGSL1在体外可以结合微丝,但不具有剪切、束化与稳定微丝及促进肌动蛋白成核的功能;PGSL1具有抑制拟南芥微丝剪切因子ADF6剪切和解聚微丝的功能,同时也具有促进百合(Lilium brownii)凝溶胶蛋白ABP29剪切微丝的能力。这表明PGSL1是一个新的微丝结合蛋白,其本身不具有调控微丝动态的特性但可能通过和其它ABPs协同调控微丝骨架的稳定性。5.通过观察花粉管细胞中的微丝结构发现,pgsl1-2突变体花粉管中的微丝排布和动态变化和野生型没有显著差异。这表明正常萌发生长的pgsl1-2突变体花粉管内的微丝动态并未受到影响。

关键词：拟南芥花粉萌发花粉管生长微丝结合蛋白肌动蛋白 PGSL1

体外RNA干扰下调PTEN表达对活化肝星状细胞微管及微丝结合蛋白cortactin和filamin A的影响

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体外RNA干扰下调PTEN表达对活化肝星状细胞微管及微丝结合蛋白cor...

作者：张明婷华北理工大学

学位级别：硕士

目的探讨RNA干扰下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten,PTEN)表达对体外培养的活化肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)微管及微丝结合蛋白皮层肌动蛋白结... 详细信息

目的探讨RNA干扰下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten,PTEN)表达对体外培养的活化肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)微管及微丝结合蛋白皮层肌动蛋白结合蛋白(cortical actin-binding protein,cortactin)和细丝蛋白A(filamin A)的影响。方法通过反复感染293T细胞,扩增携带靶向PTEN的RNA干扰序列[短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)]并表达绿色荧光(green fluorescent protein,GFP)的重组腺病毒(Ad-sh RNA/PTEN)及只表达GFP的对照空病毒(Ad-GFP);体外培养活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,将腺病毒Ad-sh RNA/PTEN及空病毒Ad-GFP转染HSC-T6,应用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测HSC的PTEN m RNA及蛋白表达;采用免疫荧光法并利用激光扫描共聚焦显微镜技术检测HSC的α微管蛋白(α-tubulin)、γ微管蛋白(γ-tubulin)及微丝结合蛋白cortactin、filamin A表达,采用Image-pro plus 6.0图像分析软件进行图像分析,计算所测蛋白荧光表达的积分光密度值(integral optical density,IOD)。采用SPSS 17.0统计软件分析实验数据,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用LSD检验,P0.05)。Western blot技术检测3组HSC的PTEN蛋白表达,Adsh RNA/PTEN组HSC的PTEN蛋白表达(1.008±0.036)明显低于control组(1.438±0.038)及Ad-GFP组(1.413±0.058),P蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。4免疫荧光法检测3组HSC的α-tubulin表达显示:α-tubulin主要表达于胞浆,Ad-GFP组和control组HSC的α-tubulin呈辐射状、丝网状均匀分布于细胞核周围,而Ad-sh RNA/PTEN组的α-tubulin向细胞两端的末梢逐渐聚集、微管稍增粗;Ad-sh RNA/PTEN组HSC的α-tubulin的荧光IOD(101495.17±5005.39)较control组(40803.00±2006.59)和Ad-GFP组(42302.50±2537.93)显著升高(P0.05)。5免疫荧光法检测各组HSC的γ-tubulin表达显示:3组HSC的γ-tubulin均主要表达于胞浆内,并可见散在星点状凝集,但星点状凝集在Ad-sh RNA/PTEN组HSC更加明显,3组HSC的γ-tubulin亚细胞分布未见明显改变;Ad-sh RNA/PTEN组HSC的γ-tubulin荧光IOD(41310.83±1544.68)较control组(20410.68±1815.53)和Ad-GFP组(20137.50±1469.49)明显升高(P0.05)。6免疫荧光法检

关键词：肝纤维化肝星状细胞第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因细胞骨架微管微丝结合蛋白皮层肌动蛋白细丝蛋白A

拟南芥钙依赖性微丝结合蛋白AtABP41的分离纯化与特性分析

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拟南芥钙依赖性微丝结合蛋白AtABP41的分离纯化与特性分析

中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会

作者：樊小雪向云任海云北京师范大学生命科学学院细胞研究所北京师范大学生命科学学院细胞研究所北京师范大学生命科学学院细胞研究所

微丝骨架的动态变化是真核细胞中许多生理活动的基础。凝溶胶蛋白超家族成员(gelsolin／villin superfamily)是目前已知的唯一Ca2+依赖性肌动蛋白结合蛋白(ABPs),研究表明,该类Ca2+依赖性ABPs对微丝具有剪切、成束、成核和成帽的功能,... 详细信息

微丝骨架的动态变化是真核细胞中许多生理活动的基础。凝溶胶蛋白超家族成员(gelsolin／villin superfamily)是目前已知的唯一Ca2+依赖性肌动蛋白结合蛋白(ABPs),研究表明,该类Ca2+依赖性ABPs对微丝具有剪切、成束、成核和成帽的功能,在微丝骨架的动态变化过程中起着重要的调节作用。但是,对于植物细胞Ca2+依赖性ABPs的了解还十分有限。本研究根据单体肌动蛋白能够与DNase Ⅰ特异性、高亲和结合的性质,首先利用DNase Ⅰ亲和层析柱特异地结合单体肌动蛋白及ABPs,然后在含有Ca2+的条件下洗脱非Ca2+依赖性的杂蛋白, 最后利用含有螯合Ca2+药品(EGTA)的洗脱液,从拟南芥中分离和纯化了一种分子量为41 kDa的 Ca2+依赖性ABP,并将其命名为AtABP41。对该蛋白进行了二级质谱分析结果表明,胰蛋白酶水解 AtABP41蛋白的11个片段和拟南芥的villin3及villin2蛋白的G4-G6区域序列相同,这是在拟南芥中首次获得的gelsolin／villin超家族的小分子量Ca2+依赖性ABP。其次,通过AtABP41体外与聚合态兔肌肌动蛋白共沉淀分析和激光共聚焦显微镜观察的实验结果均表明,AtABP41对微丝具有剪切作用,并且这种剪切作用具有Ca2+浓度依赖性。上述实验结果表明,AtABP41具有Ca2+依赖性剪切微丝的作用,是gelsolin／villin超家族的新成员。但是,该蛋白是否在活体植物细胞中对微丝骨架动态起调控作用还有待于进一步的研究。

关键词：拟南芥微丝结合蛋白 AtABP41 分离纯化特性分析

来源： cnki会议评论

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植物微丝骨架动态变化的调节

植物生理学报 2011年第1期47卷 18-26页

作者：陈琼黄善金于荣首都师范大学生命科学学院北京100048 中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室北京100049

由球形肌动蛋白聚合而成的微丝骨架,又称肌动蛋白纤维,它在细胞运动、细胞形态建成以及物质运输等诸多生命活动中发挥重要作用。细胞内微丝的解聚和聚合动态特性是微丝骨架行使功能的重要基础,并受到如微丝结合蛋白、金属离子、小G蛋白... 详细信息

由球形肌动蛋白聚合而成的微丝骨架,又称肌动蛋白纤维,它在细胞运动、细胞形态建成以及物质运输等诸多生命活动中发挥重要作用。细胞内微丝的解聚和聚合动态特性是微丝骨架行使功能的重要基础,并受到如微丝结合蛋白、金属离子、小G蛋白等各种因素的严格控制。植物细胞微丝骨架的研究虽然晚于动物细胞,但也取得了飞速发展。本文对植物细胞内微丝骨架动态变化的作用机制及一些主要调节因子的最新研究进展做一介绍。

关键词：微丝动态变化微丝结合蛋白 Ca2+ 小G蛋白肌醇磷脂

Eps15同源结构域包含蛋白2通过调控Cyclin D1-CDK4-pRb信号轴影响食管鳞癌细胞的增殖

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中国生物化学与分子生物学报 2022年第9期38卷 1174-1192页

作者：张知达邓丹霞文兵彭柳董科潘德渊郑海香廖连娣许丽艳李恩民汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室广东省潮汕沿海地区高发肿瘤分子生物学重点实验室广东汕头515041 汕头大学医学院病理学教研室广东省感染病与分子免疫病理重点实验室广东汕头515041 汕头大学医学院肿瘤研究中心广东汕头515041

微丝结合蛋白是微丝细胞骨架的重要组成成分,它们通过促进微丝的聚合和解聚来影响微丝的动力学。大量研究已经表明,微丝和微丝结合蛋白参与细胞癌变的所有阶段。我们通过对食管癌蛋白质组数据挖掘结果显示,微丝结合蛋白Eps15同源结构域... 详细信息

微丝结合蛋白是微丝细胞骨架的重要组成成分,它们通过促进微丝的聚合和解聚来影响微丝的动力学。大量研究已经表明,微丝和微丝结合蛋白参与细胞癌变的所有阶段。我们通过对食管癌蛋白质组数据挖掘结果显示,微丝结合蛋白Eps15同源结构域包含蛋白2(EHD2)在食管癌组织中低表达,且EHD2低表达的食管癌患者预后不良。以往的研究已经证明,EHD2参与调控糖代谢、自噬和肿瘤迁移。然而,EHD2在食管癌进展中的作用和机制仍不清楚。本研究旨在探究EHD2在食管鳞癌细胞中的影响及其作用机制。免疫荧光和细胞组分分离结果显示,EHD2不仅定位于细胞膜和细胞质,还存在于细胞核中。使用克隆形成实验、EdU细胞增殖实验和细胞流式术检测EHD2对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。结果显示,过表达EHD2和EHD2-3×NLS(核定位信号)抑制食管鳞癌细胞增殖和细胞周期G_(1)/S转换;同时,双荧光素报告基因结果显示,过表达EHD2和EHD2-3×NLS抑制Wnt信号通路活性。而siRNA敲降则获得相反的结果。免疫共沉淀和Duolink-PLA实验证明,EHD2与Wnt信号通路关键分子β-连环蛋白(β-catenin)和T细胞因子3(T-cell factor 3,TCF3)相互作用。蛋白质印迹和荧光定量PCR结果证实,过表达EHD2和EHD2-3×NLS抑制TCF3下游与增殖和细胞周期相关的靶基因的转录,以及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白激酶4(CDK4)和pRb的蛋白质表达。以上结果表明,核EHD2与β-catenin和TCF3复合体相互作用,通过Cyclin D1-CDK4-pRb信号轴来调控食管鳞癌细胞的增殖和细胞周期进程。

关键词：微丝结合蛋白 Eps15同源结构域包含蛋白2(EHD2) 细胞增殖 T细胞因子3 食管鳞癌

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微丝骨架在植物细胞信号转导中的作用

植物生理学通讯 2007年第5期43卷 941-948页

作者：张永梅吴忠义于荣首都师范大学生命科学学院北京100037 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心北京100090

文章从小G蛋白、离子浓度和肌醇磷脂信号系统等方面阐述植物细胞微丝骨架与细胞信号转导的关系.

关键词：微丝骨架信号转导微丝结合蛋白