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细胞周期偶联的归巢crispr生成条形码技术的研究

细胞周期偶联的归巢CRISPR生成条形码技术的研究

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作者：刘絮吟中国科学技术大学

学位级别：硕士

不断发展的细胞谱系示踪技术帮助解答了从水蛭卵裂的固定模式到肿瘤中克隆竞争力差异等诸多生物问题。利用crispr/Cas9,可在细胞基因组指定位点处逐渐引入的多样性突变以作为记录细胞谱系的条形码,在追踪过程结束后可通过测序读取并依... 详细信息

不断发展的细胞谱系示踪技术帮助解答了从水蛭卵裂的固定模式到肿瘤中克隆竞争力差异等诸多生物问题。利用crispr/Cas9,可在细胞基因组指定位点处逐渐引入的多样性突变以作为记录细胞谱系的条形码,在追踪过程结束后可通过测序读取并依此重建细胞谱系发育树。该技术目前已广泛应用于探索组织器官形成,疾病发生与演变,损伤修复与再生等科学问题,取得了无数令人瞩目的成果。然而crispr谱系示踪技术在记录容量与记录时长等方面仍面临瓶颈,难以长期追踪和精确重建复杂的多细胞发育过程,阻碍了对关键的调控和命运决定节点的深入了解。对此,研究者采取了增加记录位点数,药物诱导控制作用起始及改变核酸酶种类等方式,在不同程度上改善了谱系记录能力。其中,通过改造向导RNA令其可以在自身基因座位点处反复作用以引发多轮突变的归巢crispr谱系示踪技术脱颖而出。本文中,我们向归巢crispr系统中引入细胞周期关联控制,来应对当前方法中crispr系统持续活跃导致的信息记录容量快速衰减和记录噪声干扰问题。我们构建并验证了 6种可在自身基因组座位处产生突变的归巢向导RNA,并选取Cas9蛋白降解、mRNA转录与降解三个环节,分别尝试与细胞周期振荡器关联。我们将Geminin片段引入Cas9降解控制,证实了融合蛋白具有核酸酶活性并与归巢向导RNA兼容。Cas9hGem融合蛋白在某些程度上能够特异性地偏好S/G2/M期而在G0/G1期受到削弱,证实了细胞周期偶联降解Cas9的可行性。另一方面,我们发现CCNE1或MKI67启动子片段均可引起下游荧光素酶报告基因在不同细胞周期的特异性表达。其中,MKI67启动子片段开启转录水平相对更高,但CCNE1启动子作用窗口更窄,存在G1/S期的表达峰。我们还进一步探索了 CDK1、TOP2A、UBE2C及FBXO5四种基因的3’端非翻译区对细胞周期偶联的表达调控,结果排除了该策略调控mRNA降解的可行性。本文的研究初步探索了运用细胞周期偶联来控制归巢crispr谱系示踪系统的可行性,验证了候选的归巢向导RNA产生谱系标记码的能力,为深入探索干细胞分化及肿瘤发展等体内外应用提供了一个新的方法学框架。

关键词：谱系示踪归巢crispr 细胞周期蛋白表达调控

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