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引物3’端不同碱基错配情况下实时荧光定量PCR非特异性扩增的发生规律

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食品科学 2017年第10期38卷 277-283页

作者：李金春李家鹏周彤乔晓玲许随根戚彪米瑞芳曲超许典中国肉类食品综合研究中心肉类加工技术北京市重点实验室北京100068

以错配反应与正常反应之间的ΔCt值为指示,研究不同碱基错配类型、位置与个数条件下引物3′端与模板之间非特异性扩增的发生规律,并构建ΔCt值的二次多项式回归模型。结果表明,碱基错配种类、位置、个数对实时荧光定量聚合酶链式反应(qu... 详细信息

以错配反应与正常反应之间的ΔCt值为指示,研究不同碱基错配类型、位置与个数条件下引物3′端与模板之间非特异性扩增的发生规律,并构建ΔCt值的二次多项式回归模型。结果表明,碱基错配种类、位置、个数对实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-q PCR)的非特异性扩增都有显著影响,并呈现出较强的规律性。碱基类型上,研究的各个位置上异型错配较易发生非特异性扩增,而同型错配则较难发生,并且两种错配类型之间有显著性差异(P引物3’端第1位碱基错配对ΔCt值影响最大,错配位置远离3’端时对ΔCt值的影响逐渐减小,非特异性扩增也更容易发生;错配个数上,随着错配碱基个数的增加对ΔCt值得影响程度不断增大,非特异性扩增较难发生。构建ΔCt值预测模型R2达到0.837 1,根据此模型可以预测出不同位置、不同错配类型条件下ΔCt值,从而可以判断RT-q PCR非特异性扩增的发生的难易程度。

关键词：肉类掺假循环阈值碱基错配非特异性扩增引物特异性

PCR引物特异性核查系统(PSC)的构建与应用

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生物信息学 2010年第2期8卷 134-138,141页

作者：申志勇屈武斌李稚锋杭兴宜张成岗军事医学科学院放射与辐射医学研究所蛋白质组学国家重点实验室北京100850

聚合酶链式反应(PCR)虽已广泛用于分子生物学研究中,然而PCR实验中的非特异性产物问题将直接影响PCR的效率,在多重PCR实验中更是如此。为了最大限度地降低非特异性产物的出现率,同时避免用户频繁使用Blast比对检查非特异性,我们开发了基... 详细信息

聚合酶链式反应(PCR)虽已广泛用于分子生物学研究中,然而PCR实验中的非特异性产物问题将直接影响PCR的效率,在多重PCR实验中更是如此。为了最大限度地降低非特异性产物的出现率,同时避免用户频繁使用Blast比对检查非特异性,我们开发了基于NCBI-Blast的引物评估和模板DNA特异性结合能力评估的核查系统PSC(Primer Specificity Checking,http://***/PSC),并基于虚拟PCR实验确定了用于引物质量核查计算的多种参数,能够在线提供多个物种的引物特异性核查结果。该系统可以有效地对引物序列可能产生的所有非特异性扩增进行预测,有助于实验前引物优化或者对非特异扩增结果进行解释,最终达到提高PCR效率的目的。

关键词：引物引物对匹配指数引物特异性多重PCR

食品中单增李斯特氏菌PCR检测方法所用引物的特异性比较

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检验检疫科学 2007年第6期17卷 3-8页

作者：王海艳刘中学刘虹赵林立赵贵明袁飞内蒙古出入境检验检疫局内蒙古呼和浩特010020 中国检验检疫科学研究院 100025

[目的]对食品中单增李斯特氏菌PCR检测方法目前常用的引物进行特异性比较。[方法]用36株单增李斯特氏菌、非单增李斯特氏菌以及其他菌属的细菌,将我室的2对引物与其他作者设计的5对引物进行特异性比较。[结果]我室采用的引物FM1/FM2只... 详细信息

[目的]对食品中单增李斯特氏菌PCR检测方法目前常用的引物进行特异性比较。[方法]用36株单增李斯特氏菌、非单增李斯特氏菌以及其他菌属的细菌,将我室的2对引物与其他作者设计的5对引物进行特异性比较。[结果]我室采用的引物FM1/FM2只对单增李斯特氏菌扩增出特异性片段,引物LI1/U1只对所有李斯特氏菌属的细菌扩增出特异性片段。其他引物除了对单增李斯特氏菌扩增出特异性片段外,对其他细菌也会扩增出与特异性片段大小一致的片段。[结论]单增李斯特氏菌的特异引物FM1/FM2与李斯特氏菌属的特异引物U1/LI1组合应用,可以成为检测单增李斯特氏菌的最佳方法。

关键词：单增李斯特氏菌 PCR检测引物特异性

16S/18S/ITS扩增子高通量测序引物的生物信息学评估和改进

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微生物学通报 2020年第9期47卷 2897-2912页

作者：吴悦妮冯凯厉舒祯王朱珺张照婧邓晔中国科学院生态环境研究中心中国科学院环境生物技术重点实验室北京100085 中国科学院大学资源与环境学院北京100049 大连理工大学环境学院工业生态与环境工程教育部重点实验室辽宁大连116024 山东大学海洋研究院山东青岛266237

【背景】在过去的十几年里,基于核糖体RNA基因的扩增子测序技术被广泛用于各种生态系统中微生物群落的多样性检测。扩增子测序的使用极大地促进了土壤、水体、空气等环境中微生物生态的相关研究。【目的】随着高通量测序技术的不断发展... 详细信息

【背景】在过去的十几年里,基于核糖体RNA基因的扩增子测序技术被广泛用于各种生态系统中微生物群落的多样性检测。扩增子测序的使用极大地促进了土壤、水体、空气等环境中微生物生态的相关研究。【目的】随着高通量测序技术的不断发展和参考数据库的不断更新,针对不同的环境样本的引物选择和改进仍然需要更深入的校验。【方法】本文收集了目前在微生物群落研究中被广泛采用的标记基因扩增通用引物,包括16S rRNA基因扩增常用的8对通用引物和2对古菌引物、9对真菌转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)基因扩增引物,以及18S rRNA基因扩增的4对真核微生物通用引物和1对真菌特异性引物。这些引物中包括了地球微生物组计划(Earth Microbiome Project,EMP)推荐的2对16S rRNA基因扩增引物、1对ITS1基因扩增引物和1对18S rRNA基因扩增引物。采用最近更新的标准数据库对这些引物进行了覆盖度和特异性评价。【结果】EMP推荐的引物依然具有较高的覆盖度,而其他引物在覆盖度及对特定环境或类群的特异性上也各有特点。此外,最近有研究对这些通用引物进行了一些改进,而我们也发现,一个碱基的变化都可能会导致评价结果或扩增产物发生明显变化,简并碱基的引入既可以覆盖更多的物种,但同时也会在一定程度上降低关注物种的特异性。【结论】研究结果为微生态研究中标记基因的引物选择提供了一个广泛的指导,但在关注具体科学问题时,引物的选择仍需数据指导与实验尝试。

关键词：扩增子测序 16S rRNA基因 ITS基因 18S rRNA基因 PCR扩增引物引物覆盖度引物特异性扩增产物片段长度

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一种牛肉检测的荧光实时定量方法研究

安徽农业科学 2022年第3期50卷 198-200页

作者：马建荣余永红何远财张雅慧谭杰峰崔水龙许锦涛广东食品药品职业学院广东广州510520 广东药科大学广东广州511436 广州奕昕生物科技有限公司广东广州510520

[目的]开发一种用于牛源性成分检测的荧光实时定量检测方法。[方法]通过序列比对后,以牛源性线粒体DNA中cytb基因为模板,设计特异性的引物和探针,并以不同来源的DNA为模板,分析引物和探针的特异性。对牛源性DNA进行梯度稀释后,分析不同... 详细信息

[目的]开发一种用于牛源性成分检测的荧光实时定量检测方法。[方法]通过序列比对后,以牛源性线粒体DNA中cytb基因为模板,设计特异性的引物和探针,并以不同来源的DNA为模板,分析引物和探针的特异性。对牛源性DNA进行梯度稀释后,分析不同浓度下扩增曲线,分析检测方法的灵敏度。以牛源性DNA稀释液为模板,进行10个平行扩增试验,分析检测方法的精密度。[结果]该研究所用的引物和探针对牛源性DNA具有明显的扩增曲线,而对非牛源性(鸡、鸭、猪、人)DNA模板不进行扩增。灵敏度分析结果显示,该检测方法对浓度仅为24.4 pg/μL牛源性DNA模板仍进行阳性扩增。精密度分析显示,10个平行试验扩增曲线相似,Ct值的标准差(SD)仅为0.41,精密度(CV)也仅为1.6%。[结论]该研究开发的牛肉成分检测的荧光实时定量方法特异性高,仅对牛源性DNA发生扩增。同时该方法灵敏度也很好,检出限为24.4 pg/μL,精密度也很高,重复性良好,适用于市场上肉制品中牛源性成分的检测。

关键词：牛源性成分荧光实时定量方法引物特异性灵敏度精密度

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PCR技术在快速检测沙门氏菌中的应用

基因组学与应用生物学 2012年第1期31卷 90-94页

作者：沈兰王锐萍史海涛庞贤鹏海南师范大学生命科学学院海口571158

本文总结了PCR检测沙门氏菌过程中被检目标基因的选择、引物的特异性以及国内外检测沙门氏菌的一些实例,分析了PCR检测沙门氏菌在引物选择上存在的问题,简述了在传统PCR技术基础上发展起来的检测沙门氏菌新方法。

关键词：沙门氏菌被检目标基因引物特异性 PCR技术

应用PCR技术快速检测腐烂苹果中扩展青霉菌

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食品科学 2011年第12期32卷 183-187页

作者：何鸿举焦凌霞樊明涛张建兵吕丽娟刘晓娇李亚菲西北农林科技大学食品科学与工程学院陕西杨凌712100 河南科技学院食品学院河南新乡453003 陕西出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心陕西西安710068

利用扩展青霉的多聚半乳糖醛酸酶基因序列,设计一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)反应快速检测腐烂苹果中的扩展青霉。反应的特异性和敏感性以及反应的最适条件等试验的结果表明:该引物具有很高的特异... 详细信息

利用扩展青霉的多聚半乳糖醛酸酶基因序列,设计一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)反应快速检测腐烂苹果中的扩展青霉。反应的特异性和敏感性以及反应的最适条件等试验的结果表明:该引物具有很高的特异性和灵敏性,只扩增扩展青霉DNA,而不扩增其他真菌DNA;菌体的检测限为1.34×103个孢子/mL,DNA的检测限为2.40×10-2μg/mL;反应的最适退火温度范围为54～59℃,最适模板浓度范围为2.40～5.28μmol/L。该方法具有简单、快速、特异性好和灵敏性高等特点,可为快速检测腐烂苹果中扩展青霉的实际应用提供借鉴。

关键词：聚合酶链式反应(PCR)检测扩展青霉 DNA模板引物特异性