检索结果-南通市图书馆

作者：沙玲君上海大学

学位级别：硕士

肺癌是仅次于乳腺癌的高发恶性肿瘤,也是全球癌症死亡的首要原因。为了克服影像学筛查在早期诊断中的技术局限性,液体活检已经成为肺癌诊断领域关注的新发展方向,而肺癌外泌体是其中颇具潜力的生物标志物之一。研发准确且灵敏的肺癌外... 详细信息

肺癌是仅次于乳腺癌的高发恶性肿瘤,也是全球癌症死亡的首要原因。为了克服影像学筛查在早期诊断中的技术局限性,液体活检已经成为肺癌诊断领域关注的新发展方向,而肺癌外泌体是其中颇具潜力的生物标志物之一。研发准确且灵敏的肺癌外泌体分析新方法对于提高肺癌早期诊断的准确性和及时性具有重要的意义。核酸扩增反应是分子生物学中常用的体外扩增技术,凭借其高扩增能力与和高灵敏性的电化学检测技术结合,可以显著提升肿瘤外泌体电化学检测的灵敏性。引物交换反应是近年来新兴的核酸扩增技术,其以DNA催化发夹作为模板促发DNA循环扩增反应,可以在短时间内产生大量的特定DNA产物。因此,在本论文中,我们以引物交换反应为基础,结合成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas12a)催化的循环切割反应,显著提升了电化学检测信号并依此提出了两种肺癌外泌体定量分析的新方法。主要工作内容如下:1.基于引物交换反应的PD-L1阳性肺癌外泌体电化学分析新方法研究非小细胞肺癌是肺癌中最为常见的类型之一,占所有肺癌病例的80%以上。肺癌外泌体表面的程序性死亡配体1(PD-L1)因为可以抑制T细胞的活性,与非小细胞肺癌的病程进展密切相关,因此,PD-L1阳性的肺癌外泌体成为了一类新兴的肺癌液体活检标志物,用于非小细胞肺癌患者的早期诊断和实时监测。在这部分工作中,PD-L1阳性的肺癌外泌体首先被PD-L1抗体功能化的磁珠捕获,其后,进一步结合胆固醇功能化的催化发夹DNA,引发级联信号放大反应。级联信号放大反应从催化发夹DNA触发的引物交换反应开始,其产生的大量延伸产物可以激活Cas12a蛋白的反式切割活性。随后,Cas12a催化的随机切割反应促发了亚甲基蓝标记的DNA信号链降解反应,释放了其末端具有电活性的亚甲基蓝分子。最后,游离的亚甲基蓝分子被富集到葫芦[7]脲功能化的石墨电极表面,产生适用于PD-L1阳性肺癌外泌体定量分析的电化学信号。电化学分析结果表明,该方法在PD-L1阳性肺癌外泌体分析方面具有较高的灵敏度和特异性,线性检测范围为10至10个外泌体/毫升,检测限低至708个外泌体/毫升。同时,此方法能够在临床血清样本中有效检测PD-L1阳性的肺癌外泌体的水平变化,而且获得的电化学信号强度与肺癌病程发展呈正相关,有望用于监测非小细胞肺癌患者的病程发展。2.引物交换反应辅助的肺癌外泌体双信号电化学分析新方法研究液体活检作为一种无创或微创的非侵入疾病诊断手段,可以在一定条件下提高疾病诊断的准确率。然而,由于外泌体分泌可能受到生理或病理环境中各种因素的影响,肺癌外泌体的分泌水平存在个体差异,因而外泌体液体活检在肺癌精准诊断中可能有所局限。在这部分工作中,我们制备了两种DNA探针:一种是胆固醇修饰的DNA探针,其可以通过疏水作用插入外泌体膜;另一种是与PD-L1抗体连接的核酸-抗体探针,其可以通过特异性免疫识别与外泌体表面的PD-L1结合。同时,通过使用两种量子点(如Cd S和Pb S)分别标记DNA探针并富集相应的DNA产物,可以产生对应于总外泌体量和外泌体PD-L1水平的电化学双信号。借助电化学信号的比值可以表征外泌体分泌的个体差异,从而更加准确地在外泌体水平反映PD-L1表达状况,进一步提高肺癌患者早期筛查和分期的有效性。电化学分析结果表明,该方法可以在较宽外泌体浓度范围(10至10个外泌体/毫升)检测肺癌外泌体。当用于分析肺癌患者的临床样品时,电化学比值信号在肺癌早期筛查和分期方面表现出更好的评估准确性。

关键词：肺癌肿瘤外泌体引物交换反应 CRISPR-Cas12a 电化学检测

基于级联引物交换反应和MOF纳米酶的外泌体miRNA高灵敏检测新方法

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基于级联引物交换反应和MOF纳米酶的外泌体miRNA高灵敏检测新方法

作者：李新雨重庆医科大学

学位级别：硕士

外泌体miRNAs是重要的和可靠的生物标志物,可用于肿瘤的早期筛查和诊断。目前,外泌体miRNA的主要检测方法是定量逆转录PCR,但该方法操作复杂、耗时长且难以实现床旁检测,故其实用性受到了极大的限制。因此,发展一种灵敏、快速、简便的... 详细信息

外泌体miRNAs是重要的和可靠的生物标志物,可用于肿瘤的早期筛查和诊断。目前,外泌体miRNA的主要检测方法是定量逆转录PCR,但该方法操作复杂、耗时长且难以实现床旁检测,故其实用性受到了极大的限制。因此,发展一种灵敏、快速、简便的外泌体miRNAs检测新方法仍是亟待解决的难题。本研究提出了基于MOF@Pt@MOF纳米酶结合级联引物交换反应(PER)的超灵敏电化学策略用于外泌体miRNA检测。PER仅包含引物和门控发夹,由靶目标触发并在DNA聚合酶的作用下便可以自主和等温的方式产生一条具有重复序列域的长单链。紧接着,新生的长单链阻断保护链B,从而暴露捕获探针上纳米酶探针的结合位点,导致多层纳米酶与电化学传感界面结合。多层纳米酶是由双层Fe-MIL-88以及包裹在两层Fe-MIL-88之间的Pt NPs组成,对分解过氧化氢(HO)展现卓越的过氧化物酶样催化活性。通过多层纳米酶的催化,HO被分解为HO和O,并产生显著放大的电化学信号。受益于多层纳米酶优越的催化活性优势以及PER的双重扩增,实现了对外泌体miRNA-21超灵敏检测,动态线性范围为1 f M到1 n M,最低检测限低至0.29 f M,并且具有较高的特异性,可以区分仅具有单个碱基错配的同源miRNA。所建立的生物传感策略通过检测外泌体miRNA-21来区分乳腺癌肿瘤细胞和乳腺癌患者,其结果与qRT-PCR一致。因此,该电化学策略在肿瘤的早期诊断中具有广阔的应用潜力与价值。

关键词：金属有机框架引物交换反应纳米酶外泌体miRNA 电化学生物传感器

基于立足点介导链置换启动引物交换反应检测病原体核酸方法的构建与应用

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基于立足点介导链置换启动引物交换反应检测病原体核酸方法的构建...

作者：黎梓华南方医科大学

学位级别：硕士

背景和目的病原体核酸检测在临床诊断和治疗中起着至关重要的作用。病原体培养需要较长的时间和复杂的操作,而基于核酸的检测方法更有利于提供多种感染信息。例如,人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)基因检测对于宫颈癌筛查至关... 详细信息

背景和目的病原体核酸检测在临床诊断和治疗中起着至关重要的作用。病原体培养需要较长的时间和复杂的操作,而基于核酸的检测方法更有利于提供多种感染信息。例如,人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)基因检测对于宫颈癌筛查至关重要。世界上存在200多种HPV亚型,其中约15种高危型HPV亚型可以致癌,构建可以识别临床样本中HPV亚型的即时核酸检测方法对疾病监测和治疗非常重要。聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是最常用的病原体核酸检测方法,但它的实用性受到设备昂贵、操作繁琐、场地要求高等限制。虽然已提出了多种无需特定设备的等温扩增方法,但是这些方法都有其自身的缺陷。例如,环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)对引物设计和操作人员的要求高,且容易产生假阳性结果。因此,迫切需要开发一种简单、灵敏、特异的病原体核酸检测方法。研究方法1.基于立足点介导链置换启动引物交换反应的检测方法的构建与表征1.1设计合成引物交换反应所需的各种引物序列。1.2通过电泳、荧光光谱法对引物序列组装产物与扩增产物进行表征,验证该检测方法的可行性。1.3将本检测方法采取一步法进行检测,验证本方法采用一步法检测的可行性。1.4对反应的温度、时间、引物长度、DNA聚合酶浓度进行优化,得到最佳反应条件。2.对构建的检测方法进行性能评价与临床应用能力评估2.1在最佳反应条件下,检测不同浓度靶标产生的荧光信号,计算出线性范围和检测限,评价本方法的分析灵敏度。2.2用本方法对多种靶标进行检测,评价本方法的特异性。2.3比较针对三个不同位点的HPV-16靶标的检测体系的检测效能,验证靶标选择的重要性。2.4用本方法同时对试剂盒提取DNA和热裂解标本进行检测,评价本方法对热裂解方法的适用性。2.5用本方法检测临床标本,并与PCR方法进行比较,评价本方法的临床检测性能。结果与传统的聚合酶链反应和等温扩增技术相比,本方法更简单、快捷。通过引入立足点介导的链置换反应来提高检测特异性,结合引物交换反应(Primer Exchange Reaction,PER)强大的信号放大能力,实现高特异性和高灵敏度检测。经过优化后反应体系的DNA聚合酶浓度为0.2 U/μL、引物长度为10 nt,可在37℃恒定温度1小时内达到18 fM的检测限,同时适用于热裂解标本,进一步减少操作步骤和检测时间。通过24个宫颈脱落细胞标本、30个血浆标本、10个尿液标本验证了该体系的临床应用能力。本方法操作简单、成本低廉,具有广泛的适用性,并且很容易与目前市场上成熟设备集成一体化,实现病原体核酸即时检验(Point-of-Care Testing,POCT)。

关键词：引物交换反应链置换反应病原体核酸检测即时检验生物传感器

四面体DNA纳米结构介导的引物交换反应实现T4 PNK的活性分析

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四面体DNA纳米结构介导的引物交换反应实现T4 PNK的活性分析

作者：王兴宇重庆医科大学

学位级别：硕士

T4多核苷酸激酶是一种双功能酶,广泛参与体内重要的磷酸化和去磷酸化过程。对T4多核苷酸激酶活性的敏感性和特异性检测将有助于阐明其在疾病诊断和治疗中的关键作用。传统的检测方法采用经磷酸化基团修饰的发夹型或单链引物作为T4多核... 详细信息

T4多核苷酸激酶是一种双功能酶,广泛参与体内重要的磷酸化和去磷酸化过程。对T4多核苷酸激酶活性的敏感性和特异性检测将有助于阐明其在疾病诊断和治疗中的关键作用。传统的检测方法采用经磷酸化基团修饰的发夹型或单链引物作为T4多核苷酸激酶水解的底物。然而,考虑到底物和酶的空间距离较大和反应方向的无序,方法的效率和灵敏度受到限制。在本文中,我们提出了一种简单而灵敏的信号放大策略,将四面体DNA纳米结构与引物交换反应相结合,保证了不同的反应方向,提高了局部反应浓度。与分散的单个引物交换反应相比,局部的四面体DNA纳米结构-引物交换反应为启动信号扩增提供了更多的引物。得益于从分散到局部的独特结构转变,该策略提供了超高的灵敏度,实现了1.8×10-5 U/m L的检测限,同时在复杂的人血清和细胞裂解物环境中保持了出色的准确性和特异性。该方法成功评价了硫酸铵和磷酸氢二钠对T4多核苷酸激酶活性的抑制作用。最后,验证了该策略在无细胞提取物检测中的实际应用能力,为T4多核苷酸激酶相关生物学和医学研究提供了有前景的分析系统。

关键词：局部灵敏 T4多核苷酸激酶四面体DNA纳米结构引物交换反应

双翼开关型纳米器介导的引物交换反应用于癌症生物标志物FEN1的活性分析

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双翼开关型纳米器介导的引物交换反应用于癌症生物标志物FEN1的活...

作者：陈思忆重庆医科大学

学位级别：硕士

DNA损伤修复是导致肿瘤耐药性变化的重要因素之一。皮瓣内切酶1(FEN1)是各种DNA代谢途径中的关键酶,其分析为肿瘤研究和化疗药物的发展提供了不可估量的支持。然而,很少有分析技术可以实现定量和简化的FEN1检测。在此,我们构建了一种双... 详细信息

DNA损伤修复是导致肿瘤耐药性变化的重要因素之一。皮瓣内切酶1(FEN1)是各种DNA代谢途径中的关键酶,其分析为肿瘤研究和化疗药物的发展提供了不可估量的支持。然而,很少有分析技术可以实现定量和简化的FEN1检测。在此,我们构建了一种双翼开关纳米器件(DWSN)介导的引物交换技术(PER),用于快速和无标记地精准定量FEN1活性。靶FEN1通过识别DWSN上的三碱基错配位点,切割并释放5’-皮瓣,触发PER而产生大量不同长度的端粒重复片段。与荧光染料Th T的进一步结合后导致荧光显著增强。本研究打破了传统单个位点鉴定的局限性,表现出令人满意的灵敏度和特异性,检测限可达0.55 m U。此外,本策略可用于FEN1相关抑制剂的体外筛选和评估,定量检测人癌细胞中FEN1的活性,为肿瘤的早期筛查和靶向耐多药细胞的药物开发提供新的灵感。

关键词：皮瓣内切酶1 核酸纳米器引物交换反应肿瘤标记物

基于新型纳米复合材料及便携式血糖仪对大肠杆菌O157:H7检测方法的研究

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基于新型纳米复合材料及便携式血糖仪对大肠杆菌O157:H7检测方法...

作者：于松玲吉林农业大学

学位级别：硕士

由食源性致病菌引发的问题频繁发生,不仅威胁着人类的安全与健康,还会造成重大的经济损失。大肠杆菌*** O157:H7是食源性致病菌中最危险的细菌之一,它可以产生引起危及生命的胃肠感染,如血性腹泻、出血性结肠炎、肾衰竭和脑膜炎等。因此... 详细信息

由食源性致病菌引发的问题频繁发生,不仅威胁着人类的安全与健康,还会造成重大的经济损失。大肠杆菌*** O157:H7是食源性致病菌中最危险的细菌之一,它可以产生引起危及生命的胃肠感染,如血性腹泻、出血性结肠炎、肾衰竭和脑膜炎等。因此,基于实际需求,建立快速、准确、便携式的检测方法对于降低食源性疾病的患病率至关重要。本课题基于新型纳米复合材料、便携式血糖仪结合核酸分子扩增技术开发了两种简单、快速、超灵敏的大肠杆菌O157:H7检测方法:1.基于杂交纳米花结合HCR-DNAzyme对大肠杆菌O157:H7的可视化检测本研究基于杂交纳米花和G-四链体/hemin DNAzyme辅助杂交链式反应(HCR-DNAzyme),建立了一种简单、灵敏、可视化的检测致病性大肠杆菌O157:H7的比色免疫传感器。采用一锅法制备了负载刀豆蛋白(Con A)和DNA探针的有机-无机杂交纳米花,作为比色免疫传感器的信号标签。利用靶标抗体修饰的磁珠作为捕获元件分离致病菌和信号标签纳米花。通过HCR核酸信号放大策略中的G-四链体/hemin DNAzyme的类过氧化物酶活性催化比色反应。该生物传感器的吸光值在10～10CFU/m L范围内呈现良好的线性关系,检测限低至10 CFU/m L。该生物传感器成功应用于牛奶样品中大肠杆菌O157:H7的检测。2.基于便携式血糖仪结合引物交换反应(PER)对大肠杆菌O157:H7的超灵敏检测本研究提出了一种基于便携式血糖仪结合PER的高灵敏度和选择性致病菌检测的方法。将核酸抓取探针CP结合大肠杆菌O157:H7的适配体固定在功能性的磁珠(MBs)表面。当靶标存在时,通过分子的特异性识别作用,磁珠上与抓取探针碱基互补配对的适配体被PER产物取代,进而与修饰有蔗糖酶的核酸报告探针结合,作为信号转化和放大的元件,催化蔗糖水解为葡萄糖,用便携式血糖仪进行数据输出。实验结果表明,该生物传感器的检测限低至10 CFU/m L,靶标浓度与葡萄糖信号值在10～10CFU/m L呈现良好的线性关系,为食品安全检测领域提供了新的视角。

关键词：大肠杆菌O157:H7 血糖仪纳米复合物杂交链式反应引物交换反应

基于核酸信号放大技术的miRNA检测新方法研究

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基于核酸信号放大技术的miRNA检测新方法研究

作者：沈敏哲浙江大学

学位级别：硕士

MicroRNA（miRNA）是一类内源性且具有重要生物调控作用的短链非编码RNA分子。已有越来越多的证据表明miRNA的作用不仅局限于发育调控,其异常表达还与多种疾病,尤其是癌症的发生和发展密切相关。因此,将miRNA作为一种重要的生物标志物,... 详细信息

MicroRNA（miRNA）是一类内源性且具有重要生物调控作用的短链非编码RNA分子。已有越来越多的证据表明miRNA的作用不仅局限于发育调控,其异常表达还与多种疾病,尤其是癌症的发生和发展密切相关。因此,将miRNA作为一种重要的生物标志物,检测其在特定组织或细胞中的表达变化,可以为疾病的诊断、预后和预测提供依据,具有潜在的临床应用前景。目前大多数miRNA检测方法局限于体外定量检测,无法获取miRNA在相关组织和细胞中的表达信息。而原位成像不仅可以比较miRNA在不同细胞中的表达水平,还可以检测同一细胞中miRNA在时间和空间上的表达变化。因此,建立可同时应用于体外检测和细胞原位成像的miRNA检测方法,不仅能够用于疾病的筛查诊断,而且对miRNA的功能研究也具有重要的意义。本课题基于引物交换反应（Primer Exchange Reaction,PER）、脱氧核酶（DNAzyme）和催化发夹组装（Catalytic Hairpin Assembly,CHA）这三种核酸信号放大技术,建立了多种miRNA体外检测新方法,并成功用于miRNA的原位成像。1.基于核酸扩增的miRNA检测新方法利用引物交换反应可以恒温合成核酸链的特点,建立了一种新型的miRNA检测方法。该方法体系简单,检测迅速,检测范围为32 fmol～1024 fmol。后续研究中将PER反应与CHA技术结合,建立了PER-CHA法,进一步提高检测灵敏度,成功将检测下限提高至5 fmol,同时该方法抗生物基质干扰能力强,可在20%浓度的血清样本中完成对miR-200a的定量测定,具有临床检测的应用潜力。2.基于脱氧核酶的miRNA检测新方法利用金属离子依赖性脱氧核酶仅需相应金属离子辅助即可催化特定核酸底物裂解的特性,建立了一种新型的无酶miRNA检测方法。该方法操作简便,成本低廉,在37℃的恒温条件下实现对miR-146b的定量检测,检测范围为200 fmol～3200 fmol。同时,将脱氧核酶与CHA技术进行联用,建立了DNAzyme-CHA法,不仅将检测灵敏度提高至25 fmol,并成功应用于细胞样品中miR-146b的原位成像。本课题通过对原理的剖析,设计探针将引物交换反应应用于miRNA检测,并结合催化发夹组装技术提高了方法的检测灵敏度。为解决引物交换反应使用DNA聚合酶的局限,利用脱氧核酶这一具有催化能力的核酸分子开发了新型的无酶miRNA检测方法。同时,将其与无酶的催化发夹组装技术联用,提高了方法的灵敏度,成功将其用于miRNA的原位成像,为miRNA在相关细胞中空间表达研究提供了检测手段,也为miRNA检测方法的开发拓展了新的思路。

关键词：核酸信号放大技术引物交换反应脱氧核酶催化发夹组装 miRNA检测原位成像

基于CRISPR/Cas技术的新冠病毒Delta鉴别方法研究

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基于CRISPR/Cas技术的新冠病毒Delta鉴别方法研究

作者：谭娅河南中医药大学

学位级别：硕士

目的及时鉴别新型冠状病毒变异毒株突变是遏制其传播的最佳方法之一。常用的测序方法周期长、费用高,不能满足快速鉴别新型冠状病毒的变异毒株的需要,探索其快速、简便鉴别方法是领域内的研究热点,通过Lw Cas13a蛋白的表达纯化,获得有... 详细信息

目的及时鉴别新型冠状病毒变异毒株突变是遏制其传播的最佳方法之一。常用的测序方法周期长、费用高,不能满足快速鉴别新型冠状病毒的变异毒株的需要,探索其快速、简便鉴别方法是领域内的研究热点,通过Lw Cas13a蛋白的表达纯化,获得有活性的Cas13a蛋白;建立基于CRISPR技术的新型冠状病毒的核酸层析检测方法,并评价该方法对新型冠状病毒Delta变异毒株D614G单碱基突变检测的特异性。方法*** Cas13a蛋白的原核表达纯化:通过对其诱导温度、诱导时间及IPTG诱导剂浓度等条件进行优化,确定可溶性表达条件;通过镍亲和层析纯化蛋白并对其进行活性鉴定,以获取课题实验CRISPR反应体系中的关键试验生物活性材料;2.设计并通过CRISPR反应筛选新型冠状病毒的模板链及cr RNA:通过体外转录、RNA纯化及配对筛选,获得与模板链配对较好,且可激活Cas13a蛋白切割活性的cr RNA,以满足课题研究所需的核酸序列;3.筛选发卡结构与引物,通过优化引物交换反应（PER）扩增条件,设计并验证特异性探针,将CRISPR技术与PER后扩增技术联合后探究其灵敏度及特异性;以搭建的CRIPSR/PER核酸检测技术为载体,筛选新型冠状病毒Delta变异毒株D614G单碱基突变位点的特异性cr RNA,评价该技术对单碱基突变位点检测的特异性。结果1.确定了Cas13a蛋白诱导表达的最适温度为16℃,最佳时间16h,IPTG终浓度为1mmol/m L,纯化后的Cas13a蛋白纯度较高,对其活性鉴定后,其结果表明自制Cas13a蛋白活性较好,满足实验要求。2.获得了14条RNA序列,其中RNA-1与c RNA-1、RNA-2与cr RNA-7、RNA-3与cr RNA-11、RNA-4与cr RNA-17配对可较好激活Cas13a蛋白活性。3.筛选确定了H27发卡结构与P27引物配对的扩增效果最好;确定PER最佳扩增条件为:温度37℃,Bst DNA聚合酶加入4U,H27发卡结构加入10μL,Mg SO4加入1μL,d NTP加入2μL,扩增时间为40min;基于CRISPR/PER的核酸层析检测方法的最低检测限为:100pg/μL RNA模板链,特异性较好,该方法可特异性识别新型冠状病毒Delta变异株的D614G位点的单碱基突变。结论1.确定了Cas13a蛋白的诱导表达条件:IPTG终浓度为1mmol/L,16℃诱导表达16h;2.建立了CRISPR/PER实验室核酸检测方法,经初步测定该方法的最低检测限为100pg/μLRNA模板链,特异性较好;3.筛选确定了SARS-CoV-2原始毒株S和ORF1ab的2条cr RNA,SARS-CoV-2 Delta变异毒株D614G突变位点的特异性cr RNA,为SARS-CoV-2的检测及单碱基突变检测提供新思路。

关键词： CRISPR-Cas13a 单碱基突变核酸检测新型冠状病毒引物交换反应

基于金属有机框架材料及DNA逻辑门在活细胞中的应用

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基于金属有机框架材料及DNA逻辑门在活细胞中的应用

作者：王丹丹湖南大学

学位级别：硕士

细胞作为构成生物体的基本结构和功能单元,其生物环境中的许多特异性生物标志物与疾病的发生、分化和发展息息相关,对细胞生理功能的调节至关重要。探究细胞中特异性癌症生物分子表达水平的变化对于生物医学上开展癌症的预后和诊断的研... 详细信息

细胞作为构成生物体的基本结构和功能单元,其生物环境中的许多特异性生物标志物与疾病的发生、分化和发展息息相关,对细胞生理功能的调节至关重要。探究细胞中特异性癌症生物分子表达水平的变化对于生物医学上开展癌症的预后和诊断的研究具有重大的指导意义。细胞组成的多样性使生物环境十分复杂,通常一种疾病与一种及以上生物标志物有关或与其他疾病共享一种生物标志物。因此利用细胞内单一生物标志物的检测手段进行疾病诊断易出现“假”阳性。DNA生物逻辑门依靠DNA基于碱基互补配对的特异性和可编程性可构建多类型逻辑门。因此,以一组生物标志物作为逻辑输入构建DNA逻辑门分析肿瘤细胞内生物标志物浓度变化可提高对癌细胞鉴定的准确性。本文设计了一系列逻辑门系统,利用目前应用广泛的生物矿化的金属有机框架材料作为载体,该系统还可以在活细胞中工作以实现细胞鉴定,具体研究内容如下:(1)第二章中,开发一种基于聚合酶驱动的引物交换反应(PER)-DNAzyme级联逻辑系统用于在体外同时响应两种mi RNAs。该DNA逻辑门以mi RNAs作为输入、荧光信号作为输出、引物交换反应为传感模块、劈开型MgDNAzyme为处理模块构建了三种生物计算平台,包括AND(与)逻辑门、OR(或)逻辑门、NOT(非)逻辑门。mi RNAs作为逻辑输入,在聚合酶辅助下,引物交换反应被激活自主产生逻辑组件触发下游DNAzyme电路实现mi RNAs的体外响应。聚合酶驱动的DNA生物计算平台提供了一种创新的响应模式,进一步提高了逻辑运算的可编程性和准确性。对PER催化发夹进行重新编程,可以用于响应其他生物分子,聚合酶的引入使逻辑平台设计具有拓展性,同时丰富了逻辑组件的多样性,但该逻辑门在活细胞中的执行还有待进一步研究。(2)第三章为了实现在活细胞中执行第二章中设计的生物逻辑平台,首次报道了通过生物矿化的金属有机框架纳米材料作为共同递送聚合酶和DNA逻辑组件(核酸探针)进入细胞的载体以启动聚合酶驱动的PER-DNAzyme级联生物计算平台(AND门和OR门)在活细胞中工作,通过检测多种内源性mi RNAs实现准确的细胞鉴定。结果表明,搭建的双特异性识别的DNA生物逻辑平台具有可编程性和准确性,使细胞识别更可靠,符合生物医学的需求及其在临床诊断中的应用。该方法可对细胞中为疾病的准确预后和诊断以及复杂细胞系统中DNA逻辑门的生物医学研究提供了新的工具和思路。

关键词： DNA逻辑门引物交换反应 DNAzyme 有机框架材料细胞鉴定

聚合酶驱动的信号放大技术对小细胞外囊泡表面多种蛋白的逻辑门检测

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聚合酶驱动的信号放大技术对小细胞外囊泡表面多种蛋白的逻辑门检...

作者：胡鑫宇华东师范大学

学位级别：硕士

小细胞外囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)是一种由大多数类型细胞分泌的纳米级囊泡(30-200 nm),大量存在于唾液、精液、血液、脑脊液和尿液等体液中。它通过将信息分子(例如核酸和蛋白质)从供体细胞输送到受体来促进细胞间通... 详细信息

小细胞外囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)是一种由大多数类型细胞分泌的纳米级囊泡(30-200 nm),大量存在于唾液、精液、血液、脑脊液和尿液等体液中。它通过将信息分子(例如核酸和蛋白质)从供体细胞输送到受体来促进细胞间通讯。近年来,具有高稳定性、高特异性、携带信息丰富且易于从体液中获得的sEVs成为了最受关注的疾病标志物之一,在疾病诊断和术后监测中发挥重要作用。在疾病的发生阶段,sEVs上相关生物标志物丰度非常低,给sEVs的检测带来了很大的困难。因此,需要采用信号放大策略来提高sEVs检测的灵敏度。其中,基于核酸的信号放大,因其可编程、合成简单、生物相容性高、信号放大效果好等优点,成为了最广泛使用的策略之一。核酸信号放大策略按反应动力学可以分为线性和指数核酸信号放大。引物交换反应(primer exchange reaction,PER)和催化发夹组装(catalytic hairpin assembly,CHA)可编程、设计灵活、操作简便,信号放大效果好。将这两个策略单独使用,或级联产生指数级的信号放大,可以实现sEVs表面蛋白的灵敏检测。基于sEVs检测的疾病诊断和治疗,需要满足对sEVs进行高特异性和高准确度识别的需求。但是,体液基质成分复杂、sEVs表面蛋白存在表型异质性,因此对单种标志物检测,往往存在准确性不足的问题。DNA生物逻辑门依赖于碱基互补配对原则,可以将多种生物信号特异、准确地传入生物电路,按用户需求输出一个布尔运算后的信号,可以有效避免“假阳性”或“假阴性”。基于此,本文设计了两种基于聚合酶驱动的信号放大策略,通过对sEVs表面多种蛋白的生物信号进行逻辑分析并产生线性或指数级的荧光信号放大。这些方法将应用于乳腺细胞系来源sEVs的母细胞区分和乳腺癌(breast cancer,BC)鉴定。具体研究内容如下:第一章绪论本章主要对sEVs的概念、分类、组成、功能、分离与富集以及在液体活检中的应用进行了概述。同时,介绍了目前常用的核酸信号放大策略和DNA生物逻辑门以及在sEVs检测中的应用。最后,阐述了本论文的研究意义与内容。第二章聚合酶驱动的逻辑信号放大方法用于sEVs表面蛋白检测和BC鉴定在本章中,开发了聚合酶驱动的逻辑信号放大系统(PLSAS),可以同时检测sEVs上两种表面蛋白以及BC的鉴定。该策略以肿瘤来源sEVs上富含的粘蛋白 1(Mucin 1,MUC1)和上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)作为信号输入,用PER进行逻辑运算和信号放大,输出荧光信号。我们构建了两种生物计算模块,包括或(OR)逻辑门和与(AND)逻辑门。其中,OR逻辑门以MUC1或EpCAM蛋白作为单一信号输入时,sEVs的检测极限分别为24颗粒/μL和58颗粒/μL。而AND逻辑门对BC患者有更高的区分度,对BC阳性样本和健康人的血清检测接收者操作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析的曲线下面积(area under the curve,AUC)为 0.981。第三章聚合酶驱动的指数级信号放大用于sEVs表面多种蛋白同时检测和BC鉴定在上一章的基础上,我们设计了一种由聚合酶驱动的能自发实现PER和CHA自催化的引物循环(primer catalyzed cycle,PCC)体系并实现了 sEVs上两种蛋白的AND逻辑门检测。该策略靶向BC患者sEVs表面高表达的EpCAM蛋白和人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2),经过AND逻辑计算后输出信号。在PCC信号放大器中,仅通过四个发夹使PER引物P和CHA触发器T循环再生,实现指数信号放大。PCC大大增加了检测灵敏度,将sEVs的检测限降低至8颗粒/μL,对BC阳性患者ROC分析的AUC提升至0.992,并实现了早期和晚期BC患者的区分。

关键词：小细胞外囊泡荧光探针信号放大引物交换反应催化发夹组装