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HNRNPdL通过调控选择性剪接基因BTC促进非小细胞肺癌进展的机制研究

HNRNPDL通过调控选择性剪接基因BTC促进非小细胞肺癌进展的机制研...

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作者：曹钰洁延安大学

学位级别：硕士

目的:明确HNRNPdL(异质性核糖核蛋白d样蛋白)基因对非小细胞肺癌(NSCLC)增殖的影响,并通过RNA测序(RNA-seq)技术筛选出经慢病毒介导短发夹(shRNA)的HNRNPdL基因转染到人肺腺癌细胞中的下游差异基因,进一步研究HNRNPdL基因通过调控选择... 详细信息

目的:明确HNRNPdL(异质性核糖核蛋白d样蛋白)基因对非小细胞肺癌(NSCLC)增殖的影响,并通过RNA测序(RNA-seq)技术筛选出经慢病毒介导短发夹(shRNA)的HNRNPdL基因转染到人肺腺癌细胞中的下游差异基因,进一步研究HNRNPdL基因通过调控选择性剪接(AS)在NSCLC的发生发展中的作用。方法:1.设计含有HNRNPdL shRNA靶序列的寡核苷酸单链,构建HNRNPdL基因敲低的A549、H1299等人肺腺癌细胞株,后续实验将用转染效率达到80%的人肺腺癌细胞株,两株细胞各进行实验将分组为阴性对照组(shNC)和病毒敲低组(shHNRNPdL),并提取shNC组及shHNRNPdL组人肺腺癌细胞的Total RNA,检测HNRNPdL m RNA水平的表达变化采用逆转录实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR);检测HNRNPdL蛋白水平的表达变化采用蛋白质印迹法(Western Blot),两种方法均可验证其敲低效率。通过CCK-8法、Western Blot、划痕试验研究了HNRNPdL敲低的人肺腺癌细胞A549和H1299的生物学功能。2.选取来自A549-shNC和A549-shHNRNPdL的四对独立样本,通过TRIzol法提取细胞Total RNA进行下一代RNA-seq,检测HNRNPdL基因调控的选择性剪接事件,并通过RT-q PCR对不同RNA样本中的选择性剪接事件进行初步验证。3.为了明确下游剪接因子对NSCLC的分子机制作用,首先构建了下游基因剪接亚型的shRNA,其次通过RT-q PCR及Western Blot验证其对下游基因剪接亚型在人肺腺癌细胞A549、H1299中的敲低作用,采用CCK-8实验进一步验证细胞活力或增殖能力,检测细胞迁移能力采用伤口愈合实验即细胞划痕实验,采用Western Blot实验检测凋亡分子的表达从而明确细胞凋亡能力,进而确定下游基因剪接亚型在NSCLC发生、发展中的作用。结果:1.将重组慢病毒表达载体HNRNPdL shRNA与质粒一起转染到人肺腺癌细胞A549、H1299中,生成重组慢病毒细胞。在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白达80%左右的细胞株即可使用。采用RT-q PCR和Western Blot实验进一步表明了HNRNPdL m RNA水平和蛋白水平在其敲低的人肺腺癌细胞A549、H1299中的表达被显著降低。2.利用CCK-8法绘制细胞增殖功能曲线、增殖倍数曲线进行分析,结果显示HNRNPdL敲低的人肺腺癌细胞A549、H1299的细胞活力及增殖能力被显著抑制;采用Western Blot实验检测凋亡分子在人肺腺癌细胞A549、H1299的细胞凋亡情况,结果显示敲低HNRNPdL基因显著促进了细胞凋亡;利用细胞划痕试验分析显示敲低HNRNPdL基因的细胞迁移能力降低。3.通过RNA-seq检测HNRNPdL基因所调控的下游差异基因共568个,其上调基因241个,下调基因327个,利用Ensembl网站筛选出其调控选择性剪接事件中重要差异基因BTC。通过RT-q PCR对剪接体BTC-L(包含外显子4)、BTC-S(删除外显子4)以及BTC Total在人肺腺癌细胞A549、H1299中进行初步验证,显示BTC-L、BTC-S及BTC total均促进了人肺腺癌细胞生长。4.将重组慢病毒表达载体BTC-L、BTC-S shRNA与质粒瞬时转染到人肺腺癌细胞A549、H1299中,生成重组慢病毒细胞。在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白达80%左右的细胞株方可使用。采用RT-q PCR和Western Blot进一步验证了剪接体BTC-L、BTC-S m RNA水平及BTC蛋白水平在其敲低的人肺腺癌细胞A549、H1299中的表达被显著降低,验证了敲低转染效率。5.利用CCK-8法绘制细胞增殖功能曲线、增殖倍数曲线进行分析,结果显示BTC-L及BTC-S敲低的人肺腺癌细胞A549、H1299的细胞增殖能力被显著抑制;利用Western Blot检测凋亡分子在敲低的人肺腺癌细胞A549、H1299中的细胞凋亡能力,结果显示敲低BTC-L及BTC-S基因均显著促进了细胞凋亡;利用细胞划痕试验分析显示敲低BTC-L及BTC-S基因的细胞迁移能力均降低。结论:1.通过RNA-seq技术对HNRNPdL基因调控的选择性剪接事件的筛选,确定了下游重要剪接基因BTC,为研究下游靶基因的生物学功能提供了先决条件。2.分别敲低剪接体BTC-L、BTC-S基因均可促进NSCLC细胞系的凋亡能力,并且促进了肺腺癌细胞的增殖能力,这与HNRNPdL基因功能相一致,揭示了HNRNPdL基因调控NSCLC的生物学功能及其通过调控选择性剪接在肺癌发生发展中的作

关键词：非小细胞肺癌异质性核糖核蛋白d样蛋白选择性剪接测序剪接体

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敲低HNRNPdL基因抑制体外肺腺癌细胞的恶性表型

敲低HNRNPDL基因抑制体外肺腺癌细胞的恶性表型

引用

作者：王丽娜延安大学

学位级别：硕士

目的:通过基因芯片技术筛选出经β-榄香烯处理A549,NCI-H1299细胞后的差异基因HNRNPdL,并使用慢病毒将其敲低,明确HNRNPdL对A549、NCI-H1299细胞增殖及凋亡影响。方法:1.前期实验通过使用CCK-8法检测经β-榄香烯处理的肺腺癌细胞系的细... 详细信息

目的:通过基因芯片技术筛选出经β-榄香烯处理A549,NCI-H1299细胞后的差异基因HNRNPdL,并使用慢病毒将其敲低,明确HNRNPdL对A549、NCI-H1299细胞增殖及凋亡影响。方法:1.前期实验通过使用CCK-8法检测经β-榄香烯处理的肺腺癌细胞系的细胞活力,基于所测量的吸光度,其间接反映了活细胞的数量,反映了药物损伤细胞的能力,反映了药物对细胞的作用。根据药敏结果处理A549细胞后,通过Trizol法提取每组样品的总RNA,然后进行标记,与人类基因表达谱芯片Affymetrix(GEO数据库中大量肺癌样本数据集)杂交,通过分析每组样品的荧光强度与探针杂交的比率来鉴定基因表达水平的变化。以确定β-榄香烯治疗前后肺腺癌细胞中的差异表达基因;再采用高内涵细胞功能学筛选实验(HCS)与细胞计数法(Celigo)筛选出确定的且具有潜在的增殖与抑制功能的基因。2.构建具有敲低HNRNPdL作用的以慢病毒介导的短发夹RNA(sh RNA)。转染A549和NCI-H1299人肺腺癌细胞系,两株细胞全程实验都将分组为病毒敲低组(sh HNRNPdL)和阴性对照组(sh Ctrl);使用逆转录定量实时聚合酶链反应和Western Blot验证其敲低效率;分别通过CCK-8法、流式细胞术(FCM),划痕试验研究了HNRNPdL对A549和H1299细胞增殖、凋亡、细胞周期及迁移的影响。结果:1.β-榄香烯作用于人肺腺癌A549及NCI-H1299细胞后经CCK-8检测其IC50分别为375.5μg/ml、299.3μg/ml;而IC30=301.3μg/m L作用于A549细胞后浓度相对稳定;后续实验选择IC30为β-榄香烯作用于人肺腺癌A549及NCIH1299细胞的终浓度;2.筛选了具有显著差异表达的721个基因,包括273个上调和448个下调;采用高内涵细胞功能学筛选实验(HCS),比较基因敲低对细胞增殖速度的影响,在待选目的基因中初步筛选出增殖抑制表型明显的基因HNRNPdL;细胞计数法(Celigo)筛选出最佳干扰基因sh HNRNPdL-PSC57267并通过RNAi将其验证;3.成功构建HNRNPdL基因RNA干扰序列的慢病毒,转染肺腺癌细胞A549和NCI-H1299,在荧光显微镜下观察其转染效率,并将转染效率为80%的细胞用于后续实验;分别通过Western Blot及PCR验证HNRNPdL的敲低效率;***-8分析的结果表明,敲低HNRNPdL可抑制A549和H1299细胞的增殖。FCM分析表明,HNRNPdL敲低可促进细胞凋亡并将肺腺癌细胞阻滞在G1期生长。除此之外,划痕试验表明细胞的迁移能力呈降低趋势。结论:β-榄香烯作用于肺腺癌细胞后,经过基因芯片技术筛选出的差异基因HNRNPdL可抑制肺腺癌细胞的增殖并促进细胞凋亡。我们的发现为肺腺癌的发病机理提供了进一步的认识,并为肺腺癌的诊疗提出了新的靶标。

关键词： β-榄香烯肺腺癌异质性核糖核蛋白d样蛋白慢病毒

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