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大丽轮枝菌异核体及其后代的形态与致病力变异

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菌物系统 1998年第3期17卷 226-232页

作者：田黎王克荣陆家云南京农业大学植物保护系病虫监测与治理农业部重点开放实验室南京210095

以硝酸盐利用缺陷型突变（nit突变）和抗杀菌剂突变两种遗传标记，对大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）异核体后代的形态和致病力进行研究，结果表明，菌核型菌株与菌丝型菌株经菌丝融合形成异核体后，菌丝型菌株能恢复形成微菌核，其... 详细信息

以硝酸盐利用缺陷型突变（nit突变）和抗杀菌剂突变两种遗传标记，对大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）异核体后代的形态和致病力进行研究，结果表明，菌核型菌株与菌丝型菌株经菌丝融合形成异核体后，菌丝型菌株能恢复形成微菌核，其后代单孢菌落形成微菌核的数量明显低于菌核型亲本，且遗传性状不稳定；随着转代次数的增多，微菌核形成能力的丧失较菌核型亲本菌株快。异核体后代对棉苗的致病力变化较大，一般均低于致病力强的亲本菌株，或介于两个亲本致病力之间，或与亲本致病力相近。

关键词：大丽轮枝菌异核体形态致病力变异

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杨树溃疡病菌异核体现象的研究

林业科学 2006年第5期42卷 142-144页

作者：余仲东刘莉丽曹支敏张星耀西北农林科技大学林学院杨凌712100 中国林业科学研究院北京100091

The results of inoculation on apples with heterokaryotic strains show that heterokaryotic phenomenon is one of important reasons of poplar canker pathogenicity variation. The pathogenicity of heterokaryotic strains relates with the weak wild parental strain significantly. The study of cytology manifests nucleolus have transferred between vegetative compatibility strains. The wild parental strain usually has only one nucleolus per cell, while the heterokaryotic strain often has two or more nucleolus per cell. The analysis of ITS-rDNA-RFLP implies the pathogenicity variation may be related with cytoplasm flow.

关键词：致病力异核体 RFLP

尖孢镰刀菌异核体及其不同核型分离子的孢子萌发时期同工酶分析

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中国农业大学学报 2001年第5期6卷 15-18页

作者：李颖关国华舒石颜耀祖中国农业大学北京圆明园西路2号100094 中国农业大学生物学院

在获得尖孢镰刀菌棉花萎蔫专化型异核体菌株及其 3个稳定的不同核型分离子的基础上 ,选择孢子萌发时期的幼嫩菌丝制备粗酶提取液 ,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行了 7种同工酶分析。结果表明 ,酯酶和乳酸脱氢酶电泳图谱在 4个样品中完... 详细信息

在获得尖孢镰刀菌棉花萎蔫专化型异核体菌株及其 3个稳定的不同核型分离子的基础上 ,选择孢子萌发时期的幼嫩菌丝制备粗酶提取液 ,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行了 7种同工酶分析。结果表明 ,酯酶和乳酸脱氢酶电泳图谱在 4个样品中完全一致 ;没有致病能力的菌株在葡萄糖 - 6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的表达量高于致病力强的菌株 ;致病力强的菌株没有乙醇脱氢酶的表达。在

关键词：尖孢镰刀菌异核体同工酶核型分离子孢子萌发

棉花枯萎病菌异核体不同核型分离子表观特性及其核DNA的RAPD分析

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菌物系统 2000年第4期19卷 504-508页

作者：关国华李颖林秀萍蒋永申章红中国农业大学生物学院北京100094

切割野生型棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum菌落的菌丝尖端，得到菌株Ag149，该菌株是一个异核体，其菌落出现明显角变，自角变处经单孢分离和继代培养，得到三种表观性状稳定的分离子：Ag149-I、Ag149-II和Ag149-II... 详细信息

切割野生型棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum菌落的菌丝尖端，得到菌株Ag149，该菌株是一个异核体，其菌落出现明显角变，自角变处经单孢分离和继代培养，得到三种表观性状稳定的分离子：Ag149-I、Ag149-II和Ag149-III。它们在色素产生、菌落质地、孢子产量以及致病性上存在明显差异，但对这三种核型分离子核DNA进行RAPD分析，未发现明显差异。

关键词：棉花枯萎病菌异核体表观特性 RAPD

棉花枯萎病菌异核体的三个不同核型分离子DNA碱基组成及18S rDNA序列

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微生物学通报 2001年第5期28卷 6-9页

作者：李颖关国华蒋永申李秀玉中国农业大学生物学院北京100094

从棉花枯萎病菌 (*** .vasinfectum)异核体菌株Ag1 49的菌落角变处分离得到 3个培养特征和致病性差异明显的单孢分离子。分别测定了这 3个分离子的总DNA和核DNA的碱基组成 ,以及它们的 1 8SrDNA的部分序列 ( 1 477个碱基对 )。它们的总D... 详细信息

从棉花枯萎病菌 (*** .vasinfectum)异核体菌株Ag1 49的菌落角变处分离得到 3个培养特征和致病性差异明显的单孢分离子。分别测定了这 3个分离子的总DNA和核DNA的碱基组成 ,以及它们的 1 8SrDNA的部分序列 ( 1 477个碱基对 )。它们的总DNA (G +C)mol%差异在 0 1 %～ 0 4%之间 ;核DNA (G +C)mol%的差异在0 4%～ 0 8%范围内 ;而 1

关键词：棉花枯萎病菌 DNA碱基组成 18S rDNA序列核型分离子异核体

稻恶苗菌异核体三种核型核DNA的RAPD分析

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微生物学报 1996年第5期36卷 385-388页

作者：陈希李秀玉颜耀祖中国农业大学生物学院北京100094

利用RAPD技术,对稻恶苗菌TJ47-26异核体的紫、红、白三种核型(同核体)核DNA进行比较,用80种10bp长的随机引物进行DNA扩增,共检测了基因组中近400个位点,未发现三种核型的基因组间有明显差异,表明紫、红、白三种核型的DNA碱基序列高度相... 详细信息

利用RAPD技术,对稻恶苗菌TJ47-26异核体的紫、红、白三种核型(同核体)核DNA进行比较,用80种10bp长的随机引物进行DNA扩增,共检测了基因组中近400个位点,未发现三种核型的基因组间有明显差异,表明紫、红、白三种核型的DNA碱基序列高度相似。由此推测TJ47-26异核体的三种不同核型是来自同一个核的变异体。

关键词：稻恶苗菌异核体 DNA RAPD 植物病原真菌

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禾谷镰孢菌异核体的获得及生物学特性研究

禾谷镰孢菌异核体的获得及生物学特性研究

作者：梁思雨西南大学

学位级别：硕士

小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是小麦、大麦等粮食作物的主要病害之一,严重影响小麦产量与品质,甚至会导致部分患病小麦籽粒中产生镰刀菌毒素,其中,最为常见的有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)。现阶段而言,防治... 详细信息

小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是小麦、大麦等粮食作物的主要病害之一,严重影响小麦产量与品质,甚至会导致部分患病小麦籽粒中产生镰刀菌毒素,其中,最为常见的有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)。现阶段而言,防治小麦赤霉病的有效措施通常有利用抗病品种与化学防治两种。在现代农业生产条件下,抗病性丧失及抗药水平提高越来越成为作物稳定高产的限制因素。前期研究揭示了植物病原真菌的有性杂交、异核作用、准性生殖以及突变体等途径都与病原菌变异密切相关,因此,研究禾谷镰孢菌的异核现象以及异核现象导致的准性生殖、抗药性进化等问题是防治小麦赤霉病的理论基础。本研究利用绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)分别标记禾谷镰孢菌多菌灵抗性和敏感菌株的组蛋白HA.Z、HB,将GFP、RFP标记菌株通过原生质体融合产生异核体,并对异核体进行PCR验证、表型观察,同时测定异核体在菌丝连续转代过程中对两种抗生素及多菌灵的稳定性,以及异核体的无性产孢能力研究,从而阐述小麦赤霉病菌等同宗配合真菌通过原生质体融合产生的异核体生物学特性、继代稳定性以及无性繁殖规律,为研究同宗配合植物病原真菌的抗药性遗传进化、有益真菌的遗传育种等奠定理论基础。试验研究结果如下:1、禾谷镰孢菌荧光标记菌株的获得:通过融合PCR构建GFP基因插入多菌灵抗性菌株组蛋白HA.Z基因编码区末端的融合基因片段以及RFP基因插入多菌灵敏感菌株组蛋白HB基因编码区末端的融合基因片段。通过PEG介导的原生质体转化以及潮霉素、遗传霉素的抗性筛选获得两种荧光标记菌株。经过PCR验证、荧光观察、DAPI染色,证明了GFP和RFP成功标记了细胞核。同时,通过荧光标记菌株的生物学检测,以此来检验外源基因GFP与RFP的导入是否会对转化子表型造成影响,结果显示:在营养生长方面,各荧光标记菌株的菌丝生长速率、菌丝顶端形态、菌落形态与亲本菌株无显著差异;在生殖生长方面,各荧光标记菌株的分生孢子形态及无性产孢能力也与亲本菌株无明显差异,证明GFP和RFP的插入对组蛋白HA.Z和HB的生物学功能没有影响。2、禾谷镰孢菌异核体的获得:通过原生质体融合技术,将GFP和RFP标记菌株的原生质体进行融合,进而获得了异核体菌株。抗生素和多菌灵表型结果说明异核体菌株具有潮霉素、遗传霉素和多菌灵抗性。对异核体菌株进行PCR验证,结果显示,绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、潮霉素抗性基因以及遗传霉素抗性基因已经成功插入异核体基因组。对异核体菌丝和分生孢子进行荧光观察,结果显示,异核体菌丝中绿色荧光细胞核出现频率高于红色荧光细胞核。同时,异核体菌株无性产孢后观察单个分生孢子,发现同一分生孢子内只存在一种荧光表型的细胞核。统计分生孢子内两种荧光标记细胞核的比例,结果显示,两种细胞核的比例极不平衡,绿色荧光(多菌灵抗性)细胞核出现频率高于红色荧光(多菌灵敏感)细胞核,红色荧光细胞核占比不足1%,说明在异核体菌株中,多菌灵抗性的细胞核占主导地位。3、禾谷镰孢菌异核体的生物学特性测定:对异核体菌株的继代稳定性进行测定,结果显示,异核体菌株第一代至第五代均能在含潮霉素和遗传霉素、多菌灵和遗传霉素的平板上生长,证明了异核体具有良好的遗传稳定性。对异核体菌株的生物学特性进行测定,并与两亲本菌株进行对比,结果显示,在菌丝生长速率上,异核体菌株略低于两亲本菌株;在菌丝尖端形态上,异核体菌株大多数呈树枝分叉状,与两亲本菌株形态相似;在菌落形态上,异核体菌株产生浓密的白色气生菌丝,与亲本菌株无显著差异,同时,异核体菌株会在菌丝生长过程中产生紫红色和黄色色素,色素产生情况与多菌灵抗性菌株相似,而多菌灵敏感菌株仅产生紫红色色素;在分生孢子形态上,异核体菌株分生孢子为镰刀状,隔膜多,大多数为3个,与两亲本菌株无显著差异;在无性产孢能力上,异核体菌株的产孢量为(2.72±0.14)×10个/mL,多菌灵敏感菌株的产孢量为(0.34±0.11)×10个/mL,多菌灵抗性菌株的产孢量为(0.73±0.16)×10个/mL,异核体菌株的产孢量显著多于两亲本菌株。以上结果说明,异核体菌株总的生活力强于两亲本菌株。同时,将大量无性孢子涂布在含潮霉素和遗传霉素或多菌灵和遗传霉素的平板上,结果发现,未能筛选获得无性重组的单孢后代,说明在现有实验条件下异核体发生准性生殖的概率较低。

关键词：禾谷镰孢菌荧光蛋白标记原生质体融合异核体生物学测定

草菇数字基因表达谱揭示同核体与异核体CAZymes表达差异

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草菇数字基因表达谱揭示同核体与异核体CAZymes表达差异

作者：贵甫福建农林大学

学位级别：硕士

草菇(Volvariella volvacea)为草腐真菌，在热带和亚热带地区是一种重要的食用真菌。草菇野生种多生长在稻草等草本植物上。而生产中，多以稻草或废棉等富含纤维素、半纤维素的材料为基质进行草菇栽培。草菇降解木质纤维素的能力是提高... 详细信息

草菇(Volvariella volvacea)为草腐真菌，在热带和亚热带地区是一种重要的食用真菌。草菇野生种多生长在稻草等草本植物上。而生产中，多以稻草或废棉等富含纤维素、半纤维素的材料为基质进行草菇栽培。草菇降解木质纤维素的能力是提高草菇在木质纤维素基质上的产值的主要限制因素。本研究基于Illunina/Solexa新一代测序技术，报道了草菇同核体菌株PYd15和PYd21及异核体菌株H1521的数字基因表达谱(3'-tag digital gene expression，DGE)。结合本实验室先前完成的草菇基因组和转录组测序数据，本论文研究了草菇基因组内碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzyme, CAZymes)家族及纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶子家族，分析比较了12种生物质降解真菌基因组内的CAZymes家族情况。并在此基础上，初步探索了草菇同核体与异核体菌株CAZymes编码基因的差异表达，以待阐明其与生物学效率变化之间的关系。通过CAZy数据库(Carbohydrate-Active Enzyme database)，草菇基因组注释到192个糖苷水解酶（glycoside hydrolase, GH）、44个糖基转移酶(glycosyltransferase, GT)、19个多糖裂解酶(polysaccharide lyase, PL)和31个糖酯酶(carbohydrate esterase, CE)。研究表明，草菇基因组内的CAZymes家族规模大于多数生物质降解真菌。在本研究分析的12种生物质降解真菌基因组中，草菇CAZymes家族规模位居第四，仅次于构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、裂褶菌(Schizophyllum commune)和灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)。在所分析的8种担子菌中，草菇基因组内的GH、PL和CE编码基因都多于其平均值（161,8,24）。但是其GT编码基因略低于平均值（65）。对8种担子菌的主要木质纤维素降解酶家族进行双聚类分析。结果显示，草菇富含降解果胶、半纤维素和纤维素的酶类编码基因。在所分析的担子菌中，草菇含有最多的植物细胞壁多糖降解相关基因。草菇基因组尤其富含GH10（降解半纤维素）和GH43（降解半纤维素和果胶）的成员，以及PL1、PL3和PL4的成员（降解果胶）。利用DGE，本研究分析比较了同核体菌株PYd15和PYd21及异核体菌株H1521的全基因表达情况。30845个参考基因中，54.47%至少在一个菌株内有表达。同时，各菌株所特异表达的基因都较少。这表明，各菌株内特异表达基因所受的调控将更加严格。为了鉴定三菌株间的基因差异表达，共筛选出6465个差异表达基因。在DGE测序的三个草菇菌株中，分析比较其CAZymes表达情况。结果显示，至少在一个菌株内表达的CAZymes编码基因共有246个。其中，共表达基因有177个。与同核体PYd15相比，异核体H1521上调表达的CAZymes编码基因有21个;与同核体PYd21相比，H1521上调表达的CAZymes编码基因有40个。研究表明，与同核体菌株相比，草菇异核体菌株的生物质降解能力具有明显的优势。本研究中，我们分析比较了草菇基因组和目前已经发表基因组序列的11种生物质降解真菌的CAZymes家族及相应的果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶子家族。并分析比较了草菇同核体与异核体CAZymes的差异表达情况。在草菇基因组与转录组测序的支持下，通过高通量测序和生物信息学分析，研究了草菇CAZymes家族基因的表达情况，进一步探究了草菇同核体与异核体基因表达谱与核型之间的关系，以待解释CAZymes编码基因差异表达与同核体与异核体之间的关系，为深入理解草菇CAZymes家族和生物质降解机理奠定理论基础。

关键词：草菇碳水化合物活性酶同核体异核体数字基因表达谱

羊肚菌异核体菌丝形成及菌丝衰老过程中DNA甲基化研究

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羊肚菌异核体菌丝形成及菌丝衰老过程中DNA甲基化研究

作者：舒芳华中农业大学

学位级别：硕士

羊肚菌(Morchella spp.)具有较高的食药用价值,近几年人工栽培取得重要进展。但羊肚菌遗传学基础研究薄弱,生活史还不十分清晰,影响了羊肚菌育种和栽培技术的创新发展。此外,羊肚菌菌种具有快速衰退的特性,菌种退化受到内外因素共同调节... 详细信息

羊肚菌(Morchella spp.)具有较高的食药用价值,近几年人工栽培取得重要进展。但羊肚菌遗传学基础研究薄弱,生活史还不十分清晰,影响了羊肚菌育种和栽培技术的创新发展。此外,羊肚菌菌种具有快速衰退的特性,菌种退化受到内外因素共同调节,具有遗传与表观遗传共同调控的网络。本研究以梯棱羊肚菌(Morchella importuna)单孢同核体菌株M04M24(MAT1-1交配型)和M04M26(MAT1-2交配型)为材料,采用农杆菌介导的遗传转化技术(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT),获得细胞核荧光标记的转化子,研究了异核体菌丝形成过程。采用全基因组重亚硫酸盐测序技术(Whole genome bisulfite sequencing,WGBS),对梯棱羊肚菌M04及六妹羊肚菌(Morchella sextelata)114号出发菌株和衰老菌株进行全基因组甲基化水平及差异甲基化区域(Differentially methylated region,DMR)分析。主要研究结果如下:(1)克隆了梯棱羊肚菌组蛋白H2B基因,构建组蛋白荧光蛋白融合表达载体,采用ATMT技术进行梯棱羊肚菌同核体菌丝遗传转化,实现细胞核荧光标记。获得了e GFP荧光标记的M04M24阳性转化子和m Cherry荧光标记的M04M26阳性转化子,将不同交配型的转化子在培养基上进行杂交,荧光观察发现杂交子菌丝细胞核中同时表达e GFP和m Cherry荧光,直观地观察到不同交配型的梯棱羊肚菌菌丝可以交配完成杂交反应,形成异核体菌丝。(2)梯棱羊肚菌M04和六妹羊肚菌114号菌株随着继代培养次数的增加,生长速度逐渐变慢,同时有明显黄色色素产生,菌种发生退化现象。M04出发菌株和衰老菌株整体甲基化水平分别为5.95%和6.80%,114号出发菌株和衰老菌株整体甲基化水平分别为7.97%和6.95%。在4个甲基化文库中,不同序列背景下的DNA甲基化水平都是CG>CHH>CHG。与其他调控元件相比,在富含重复序列的repeat区域,3种序列的平均甲基化水平最高。差异甲基化分析表明,在M04菌株和114号菌株中分别检测出13781个和16354个DMRs,它们分别涉及到1043个和1005个差异甲基化基因(Differentially methylated gene,DMG),其中CHH序列类型的DMGs多于其他序列。在M04菌株中3种序列发生低甲基化的比例更高,在114号菌株中高甲基化更偏好于发生在CG和CHG序列。在M04和114号菌株中各随机挑选了2个基因片段,采用常规重亚硫酸盐测序法验证片段的甲基化水平,其与WGBS结果一致。该研究首次采用细胞核荧光标记法直观地观察到梯棱羊肚菌异核体菌丝形成,并从DNA甲基化角度开展了菌丝衰老机制的初步研究,一方面有利于深入了解梯棱羊肚菌的生活史,另一方面为开展羊肚菌遗传学研究和培育优质菌种奠定坚实基础,具有重要意义。

关键词：羊肚菌异核体细胞核荧光蛋白标记 DNA甲基化继代培养菌种退化