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10-23脱氧核酶对结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶表达的影响及其抗菌作用

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中华结核和呼吸杂志 2006年第8期29卷 531-535页

作者：李俊明李娜朱道银伊正君刘晔华杨春何永林重庆医科大学微生物学与免疫学教研室 400016

目的探讨10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRZ)抑制结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase,ICL)的表达及其在抗结核分枝杆菌感染中的作用。方法根据计算机模拟的结核分枝杆菌ICL mRNA的二级结构设计合成5条ICL特异的10-23 DRZ(DZ1～... 详细信息

目的探讨10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRZ)抑制结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase,ICL)的表达及其在抗结核分枝杆菌感染中的作用。方法根据计算机模拟的结核分枝杆菌ICL mRNA的二级结构设计合成5条ICL特异的10-23 DRZ(DZ1～DZ5),在无细胞反应体系中鉴定其对结核分枝杆菌ICL mRNA的切割活性后,在不同条件下用DZ4对结核分枝杆菌进行处理,于处理后不同时间检测ICL酶活性变化,间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测ICL的表达。用异烟肼单独处理及DZ4与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌感染人巨噬细胞系THP-1细胞,于感染后不同时间用Ziehl-Heelson染色法和结核分枝杆菌培养计数的方法,观察10-23DRZ对结核分枝杆菌感染巨噬细胞的影响,同时取经异烟肼单独处理及DZA与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌接种于Middle Brook 7H10(M7H10)培养基,观察10-23DRZ对在巨噬细胞外生长的结核分枝杆菌的影响。结果DZ1、DZ3、DZ4和DZ5在无细胞反应体系中可对ICL mRNA进行有效切割,且其活性具有高度特异性。5μmol／L DZ4与异烟肼联合应用时可显著抑制结核分枝杆菌ICL的表达,与单用相应浓度的异烟肼比较,处理1、2、3周后结核分枝杆菌ICL酶活性分别下降34．9％、46．6％、46．7％(异烟肼10μg／L)或21．9％、33．48、36．9％(异烟肼5μg/L)。DZ4与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活的能力显著下降,在感染后4 d和7 d时,THP-1细胞内的荷菌量分别由单用相应浓度异烟肼处理对照组的126．5×104 CFU、307．5×104 CFU(异烟肼10μg／L)和133．0×104 CFU、325．4×104 CFU(异烟肼5μg／L)下降至54．6×104 CFU、114．3×104 CFU和71．7×104 CFU、174．4×104 CFU。10-23DRZ对结核分枝杆菌在M7H10培养基中生长无明显影响。结论异烟肼可有效促进10-23DRZ进入结核分枝杆菌;10-23DRZ与亚抑菌浓度的异烟肼联用可有效抑制结核分枝杆菌ICL的表达,降低其在巨噬细胞中的存活能力。

关键词：分枝杆菌结核异柠檬酸裂合酶基因表达

结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶对耻垢分枝杆菌胞内存活的影响及相关机制

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中华医学杂志 2008年第8期88卷 551-554页

作者：李俊明万腊根朱道银李娜何永林杨春南昌大学第一附属医院检验科 330006 重庆医科大学免疫学教研室

目的明确结核分枝杆菌（MTB）异柠檬酸裂合酶（ICL）对耻垢分枝杆菌（MS）在巨噬细胞内存活的影响，并初步探讨其可能的机制。方法构建MTB—icl基因的穿梭表达质粒pUV15-icl，电转化法导入MS中后检测MTB—ICL在MS中的表达。分别用rMS—p... 详细信息

目的明确结核分枝杆菌（MTB）异柠檬酸裂合酶（ICL）对耻垢分枝杆菌（MS）在巨噬细胞内存活的影响，并初步探讨其可能的机制。方法构建MTB—icl基因的穿梭表达质粒pUV15-icl，电转化法导入MS中后检测MTB—ICL在MS中的表达。分别用rMS—pUV15-icl和rMS-pUV15感染鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞，于感染一定时间后测定细胞内存活的细菌数，评价***对MS在巨噬细胞内存活的影响。分别留取上述两组巨噬细胞的培养上清液，检测干扰素γ（IFN-γ）和一氧化氮（NO）的水平，同时采用原位TUNEL技术检测两组巨噬细胞的凋亡水平，探讨MTB-ICL对MS在巨噬细胞内存活影响的可能机制。结果RT—PCR、Western印迹和荧光显微镜检测结果证实MTB-ICL可在MS中有效表达。与rMS-pUV15比较，rMS—pUV15-icl在巨噬细胞内的存活率明显高（P〈0．01），感染后24h和48h，其菌落数分别为（32．78±2．90）×10^3和（23．33±2．34）×10^3，而rMS—pUV15菌落数分别为（14．67±2．45）×10^3和（2．28±0．25）×10^3。MTB-ICL对巨噬细胞产生IFN-γ和NO没有明显影响。原位凋亡检测结果显示，与rMS—pUV15感染组比较，rMS-pUV15-icl感染组巨噬细胞的凋亡水平明显下降。结论MTB-ICL可促进MS在巨噬细胞内的存活，其机制之一可能是抑制宿主巨噬细胞的凋亡。

关键词：异柠檬酸裂合酶分枝杆菌结核耻垢巨噬细胞凋亡

乙酰化修饰调控结核杆菌异柠檬酸裂合酶的研究

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中国生物工程杂志 2015年第6期35卷 8-13页

作者：李瑶瑶毕静王艺红秦云贺张雪莲复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200433

目的:探索结核杆菌异柠檬酸裂合酶(ICL)蛋白322位点赖氨酸(Lys322)的乙酰化修饰对蛋白功能的调控作用。方法:构建结核杆菌ICL蛋白原核表达载体p ET28a-icl,并对Lys322位点进行定点突变为精氨酸(Arg,R)和谷氨酰胺(Glu,Q),体外表达纯化获... 详细信息

目的:探索结核杆菌异柠檬酸裂合酶(ICL)蛋白322位点赖氨酸(Lys322)的乙酰化修饰对蛋白功能的调控作用。方法:构建结核杆菌ICL蛋白原核表达载体p ET28a-icl,并对Lys322位点进行定点突变为精氨酸(Arg,R)和谷氨酰胺(Glu,Q),体外表达纯化获得重组蛋白ICLWT、ICL322R和ICL322Q。通过Western blotting和酶活性测定来揭示Lys322位点突变前后对蛋白的乙酰化修饰水平及蛋白功能的影响。结果:Western blotting检测发现大肠杆菌表达体系获得的ICLWT、ICL322R和ICL322Q蛋白均有较高水平的蛋白赖氨酸乙酰化修饰信号,较ICLWT,ICL322R和ICL322Q突变蛋白的酶活性分别下降了大约50%和70%。结论:在大肠杆菌的表达体系中,ICL蛋白可以获得乙酰化修饰。ICL322Q突变蛋白酶活性的显著下降,揭示Lys322位点乙酰化修饰对ICL蛋白的功能存在负向调控。为未来深入探索赖氨酸乙酰化修饰对结核杆菌代谢,潜伏感染的调控作用奠定了基础。

关键词：异柠檬酸裂合酶乙酰化修饰定点突变

异柠檬酸裂合酶定性测定法快速鉴定鼠疫菌培养物的评价

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地方病译丛 1983年第3期 27-29页

作者：任士明费来玺

Hillier 和 Charnetzky 二氏曾报道,鼠疫菌(Yersinia pestis)培养物中具有高水平的异柠檬酸裂合酶活性。他们描述了这种酶的快速化学测定法,并且用这个方法检查的所有108株鼠疫菌培养物都获得了阳性结果,而检查的各种其他肠道菌的1,608株培

关键词：鼠疫菌杆菌异柠檬酸裂合酶培养物

酵母双杂交筛选结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶的相互作用蛋白

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酵母双杂交筛选结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶的相互作用蛋白

作者：申严杰西南大学

学位级别：硕士

结核病至今仍威胁着人类的健康。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）可以在寄主体内进入休眠状态，复苏促进因子（resuscitation-promoting factor,Rpf）可激活休眠的结核菌。微生物体内的乙醛酸循环对微生物度过营养贫乏... 详细信息

结核病至今仍威胁着人类的健康。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）可以在寄主体内进入休眠状态，复苏促进因子（resuscitation-promoting factor,Rpf）可激活休眠的结核菌。微生物体内的乙醛酸循环对微生物度过营养贫乏阶段具重要作用，该循环的异柠檬酸裂解酶（Isocitrate lyase,ICL）对某些如白色假丝酵母（Candida albicans,C. albican）等真菌和沙门氏菌、结核分枝杆菌等细菌的毒力和持续感染是必须的。用酵母双杂交筛选结核分枝杆菌ICL和其他蛋白质之间的相互作用，有助于进一步理解并研究结核分枝杆菌的致病机理。本论文的目的是采用酵母双杂交技术从人肝脏cDNA库中筛选与ICL相互作用的蛋白。将克隆的结核分枝杆菌icl构建到BD载体，自激活检测通过后，和AD库共转酵母细胞，LacZ检测后，抽提酵母质粒，转化大肠杆菌，所抽质粒分别同BD空载和重组BD共转酵母细胞，通过X-Gal检测后测序并在数据库中比对鉴定。结果所筛阳性克隆为145个，4个通过验证，其中3个均为补体成分C3的C末端片段。C3作为补体系统的关键组分，为该系统的3条途径所共有。对ICL和C3的相互作用的研究将有助于理解并揭示结核分枝杆菌与免疫系统的关系，为新的抗结核药物的开发提供新的思路。为了解C3的其他相互作用蛋白，将所得C3构建到BD载体后继续用上述相同的酵母双杂交技术筛选。结果只有一个阳性克隆，且该克隆通过验证后鉴定为zyxin。在人类组织中广泛表达的zyxin，介导细胞的生长和迁移，调节细胞骨架的组装等。C3和zyxin相互作用的进一步研究将对细胞活动有更深入的了解。

关键词：结核分枝杆菌酵母双杂交异柠檬酸裂合酶补体成分C3 Zyxin

基于结构分枝杆菌异柠檬酸裂合酶的高通量药物筛选模型的构建与应用

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基于结构分枝杆菌异柠檬酸裂合酶的高通量药物筛选模型的构建与应...

作者：柏冰西南大学

学位级别：硕士

结核病严重影响人类健康。潜伏期感染是其化疗疗程偏长、疗效不佳及化疗后再次复发的主要原因,也是结核病控制形势严峻的主要因素之一。异柠檬酸裂合酶(Isocitrate lyase,ICL)在结核菌的潜伏期致病中起至关重要作用,是一个潜在的药物靶... 详细信息

结核病严重影响人类健康。潜伏期感染是其化疗疗程偏长、疗效不佳及化疗后再次复发的主要原因,也是结核病控制形势严峻的主要因素之一。异柠檬酸裂合酶(Isocitrate lyase,ICL)在结核菌的潜伏期致病中起至关重要作用,是一个潜在的药物靶标。它作为乙醛酸循环的第一个关键酶,催化异柠檬酸裂解生成琥珀酸和乙醛酸,从而改变碳源的流向,有利于碳源的积累,为结核菌在以脂肪酸或乙酸为碳源的环境下生长提供了有利条件。因此筛选新型的ICL抑制剂,有利于抗结核药物的开发。本文通过PCR方法获得ICL的编码序列,克隆至原核表达载体pQE30;将重组质粒pICL-pQE30转化大肠杆菌JM109,优化可溶性重组蛋白的表达,Ni sepharose纯化可溶性重组蛋白。研究酶反应的线性范围以及反应时间,考察DMSO对ICL活力的影响,对测活条件进行优化,确定反应体系,并对高通量筛选模型进行评价。建立ICL抑制剂高通量筛选的标准化操作流程。对475个中药提取物进行筛选,初筛和双复孔复筛后,挑选抑制率大于>50%的样品进行浓度梯度测定,计算IC。结果显示重组ICL基因工程菌构建成功,纯化方案简单可行,得到的重组ICL纯度达到90%以上,酶活力达到25676U/L,模型参数S/N和Z因子的值分别为12.7和0.72,说明该模型适用于高通量筛选。在对475种中药提取物的筛选中,筛选得到两种对ICL有明显抑制作用的中药XHD-1和XHD-2提取物,其IC分别为0.0477±0.0169和0.0182±0.0009mg/ml。对其进一步分离、纯化活性物质,可望获得抑制活性更强的重组结核分枝杆菌ICL的中药抑制剂,为抗结核药物的开发打下了良好的基础。

关键词：异柠檬酸裂合酶结核分枝杆菌高通量筛选模型中药抑制剂

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鼠疫菌的异柠檬酸裂合酶

地方病译丛 1980年第1期 87-88页

作者：王淑纯

在鼠疫菌的粗制提取液中检出了乙醛酸支路酶和苹果酸盐合酶以及异柠檬酸裂合酶,在以醋酸盐作为主要碳源和能源的培养

关键词：异柠檬酸裂合酶醋酸盐能源支路酶的活性乙酸盐鼠疫菌乙醛酸

结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶对分枝杆菌胞内存活的影响及其相关机制研究

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结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶对分枝杆菌胞内存活的影响及其相关机...

结核分枝杆菌持留状态体内外模型的建立与检测

中华医学会第七次全国检验医学学术会议

作者：李俊明南昌大学第一附属医院

目的明确结核分枝杆菌(Mvcobacterium tuberculosis,MTB)异柠檬酸裂合酶(isocitrate lvase,ICL)对耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内存活的影响.并初步探讨其可能的机制。方法采用PCR方法从MTB H37Rv基因组中扩增icl基因.克隆人大肠杆菌-分枝杆... 详细信息

目的明确结核分枝杆菌(Mvcobacterium tuberculosis,MTB)异柠檬酸裂合酶(isocitrate lvase,ICL)对耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内存活的影响.并初步探讨其可能的机制。方法采用PCR方法从MTB H37Rv基因组中扩增icl基因.克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pUV15中.构建MTB-icl基因的穿梭表达质粒pUV15-icl。将pUV15-icl经电转化方法导入耻垢分枝杆菌Ms 1- 2c中.分别采用RT-PCR、Western-blot方法和荧光显微镜法检测MTB-ICL在耻垢分枝杆菌中的表达。然后分别用rMS-pUV15-icl和rMS-pUV15感染鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞.于感染一定时间后测定细胞内存活的细菌数.评价MTB-ICL对耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内存活的影响。分别留取上述两组巨噬细胞的培养上清液,检测其IFN-γ和一氧化氮(NO)的水平,同时采用原位TUNEL技术检测两组巨噬细胞的凋亡水平.探讨MTB-ICL对耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内存活影响的可能机制。结果RT-PCR、Western-blot检测结果表明MTB-ICL可在耻垢分枝杆菌中有效表达.荧光显微镜检测结果证实当MS被巨噬细胞吞噬后.MTB-ICL仍然能够在耻垢分枝杆菌中表达。与rMS-pUV15比较.rMS-pUV15-icl在巨噬细胞内的存活率明显提高.感染24 h和48 h后.菌落数分别从(14.67±9.45)×103和(2.28±0.25)×103提高至(32.78±2.90)×103和(23.33±2.34)×103。与rMS-pUV15相比,rMS-pUV15-icl感染后巨噬细胞产生的IFN-γ和NO水平没有显著差异.说明MTB-ICL对巨噬细胞产生IFN-γ和NO没有明显影响。原位凋亡检测结果显示.与rMS-pUV15感染组比较.rMS-pUV15-icl感染组巨噬细胞的凋亡水平明显下降。结论MTB-ICL可促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活.其机制之一可能是抑制宿主巨噬细胞的凋亡。

关键词：异柠檬酸裂合酶分枝杆菌结核耻垢巨噬细胞凋亡

来源： cnki会议评论

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中华结核和呼吸杂志 2007年第3期30卷 211-215页

作者：陆宇高孟秋赵伟杰王彬马丽萍朱莉贞北京市结核病胸部肿瘤研究所药理研究室 101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所结核内科 101149

目的建立体内外结核分枝杆菌持留状态模型,检测在不同条件和化疗阶段中结核分枝杆菌持留菌,探讨其与化学治疗的关系。方法应用低氧培养、定量逆转录聚合酶链反应测定结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(ICL)、小分子热休克蛋白(Acr)及85B蛋白的... 详细信息

目的建立体内外结核分枝杆菌持留状态模型,检测在不同条件和化疗阶段中结核分枝杆菌持留菌,探讨其与化学治疗的关系。方法应用低氧培养、定量逆转录聚合酶链反应测定结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(ICL)、小分子热休克蛋白(Acr)及85B蛋白的 mRNA 表达变化的方法检测体内外模型中结核分枝杆菌持留菌。结果体外及动物模型中均存在结核分枝杆菌低氧培养阳性,体外模型中结核分枝杆菌 ICL mRNA 和 Acr 蛋白 mRNA 在低氧条件下表达逐渐增加,4 d 时显著增加,其对数值分别为(5.3±0.9)和(6.4±1.6)拷贝/ml,而85B mRNA 在有氧条件下明显增加,10 d时的对数值为(6.1±0.9)拷贝/ml,在低氧条件下无明显变化。在小鼠感染与治疗模型中,ICL mRNA在感染的2周和4周均有表达,在治疗4周后下降;ActmRNA 在感染4周及治疗4周不表达或表达很少,治疗8和10周表达量增加,10周的对数值为(6.2±1.7)拷贝/ml,治疗12周直至停药后4周仍有表达,停药4周的对数值为(3.0±1.6)拷贝/ml;而85B 蛋白 mRNA 则在治疗前高表达,对数值为(6.4±1.1)拷贝/ml,随着治疗时间延长而逐渐降低,治疗12周时测定值为阴性。结论成功建立了结核分枝杆菌持留状态的体外及动物模型,ICL mRNA、Acr 蛋白 mRNA 高表达可作为持留菌存在的标志,应用液体低氧培养并联合 mRNA 检测有可能检测到结核分枝杆菌持留菌。

关键词：分枝杆菌结核异柠檬酸裂合酶逆转录聚合酶链反应