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TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

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植物保护 2024年第2期50卷 219-227,239页

作者：孙爱青王丽花张艺萍杨秀梅许凤苏艳云南省农业科学院花卉研究所云南省花卉育种重点实验室国家观赏园艺工程技术研究中心昆明650205 云南大学昆明650091

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标... 详细信息

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

关键词：建兰花叶病毒齿兰环斑病毒 TaqMan探针 RT-qPCR 兰花

一步法RT-LAMP-HNB检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立

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广东农业科学 2022年第5期49卷 95-101页

作者：徐匆黄皓罗华建杜见南黄晓彦陈彦梁卫驱胡珊东莞市农业科学研究中心广东东莞523086

【目的】全世界兰花病毒有50余种,建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿舌兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒病,因此建立针对病毒的高效监测、检测方... 详细信息

【目的】全世界兰花病毒有50余种,建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿舌兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒病,因此建立针对病毒的高效监测、检测方法,对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【方法】以兰花病毒CymMV和ORSV为试验材料,采用反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)进行病毒RNA的扩增,从而建立CymMV和ORSV的快速检测方法。分别根据两种病毒的cp基因序列保守区设计RT-LAMP引物,在一步法RT-LAMP反应体系中加入羟基萘酚蓝(HNB,终浓度200 μmol/L)作为扩增产物指示剂,不需开盖进行凝胶电泳检测,便可直接根据体系颜色变化判读反应结果。【结果】利用该检测方法能够在2 h测出样品中是否存在CymMV和ORSV病毒RNA,其灵敏度是RT-PCR的10倍。对20株田间样品进行一步法RT-LAMP-HNB检测,根据田间检测结果显示,CymMV检出率为70%,ORSV检出率为55%,与RT-PCR结果保持一致,该法适用于田间样品检测。【结论】建立的一步法RT-LAMP-HNB是一种灵敏、快速、特异、便捷的CymMV和ORSV检测方法,仅需要简单控温设备如水浴锅便可进行核酸扩增,适用于在基层或不便利地区推广使用。

关键词：建兰花叶病毒齿舌兰环斑病毒反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP) 羟基萘酚蓝(HNB) cp基因

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建兰花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

微生物学报 2007年第5期47卷 928-931页

作者：孟春梅吴建祥谢礼郑锦凯洪健周雪平浙江大学生物技术研究所杭州310029 浙江森禾种业股份有限公司杭州310020

用建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(2C6、5B7和12G9),分别制备它们的单抗腹水。其中5B7和12G92株单... 详细信息

用建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(2C6、5B7和12G9),分别制备它们的单抗腹水。其中5B7和12G92株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,3株单抗的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测CymMV的方法。蝴蝶兰病叶作1∶10240倍稀释、提纯CymMV病毒浓度为4.87ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.487ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA方法检测了田间样品,发现CymMV在兰花上发病很普遍。

关键词：建兰花叶病毒单克隆抗体 ACP-ELISA

蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的实时荧光定量PCR检测

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江苏农业科学 2023年第15期51卷 21-28页

作者：宋起萱浦艳飞余蓉培瞿素萍杨春梅吴丽芳汪国鲜阮继伟云南大学资源植物研究院云南昆明650504 云南省农业科学院花卉研究所/国家观赏园艺工程技术研究中心云南昆明650205 玉溪云星生物科技有限公司云南玉溪653100

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,简称ORSV)是蝴蝶兰生产中的主要病毒病害,建立稳定、灵敏的检测体系是进行病毒早期检测和脱毒技术研究的前提。本研究首先对CymMV和ORSV... 详细信息

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,简称ORSV)是蝴蝶兰生产中的主要病毒病害,建立稳定、灵敏的检测体系是进行病毒早期检测和脱毒技术研究的前提。本研究首先对CymMV和ORSV的外壳蛋白(coat protein,简称CP)基因片段进行克隆和序列比对,随后设计特异性引物,分别构建2种病毒的RT-qPCR(real time quantitative PCR,简称RT-qPC)检测体系,并对云南地区20份样品进行检测。研究结果显示,CymMV和ORSV CP基因序列与其他地区分离物中这2种病毒的核苷酸序列相似性分别为97.92%~98.66%和99.12%~99.56%,其CP基因序列具有保守性。CymMV和ORSV在RT-qPCR体系中最低检出浓度分别为30.9、35.0 copies/μL,灵敏度较RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,简称RT-PCR)提高10倍。利用RT-qPCR体系对20份温室样品进行检测,CymMV阳性率为100%,ORSV阳性率为90%,阳性率均高于RT-PCR检测结果。本研究构建的CymMV和ORSV RT-qPCR检测体系将为蝴蝶兰病毒病早期监测和脱毒种苗的培育奠定基础。

关键词：蝴蝶兰建兰花叶病毒齿兰环斑病毒实时荧光定量PCR 病毒检测

建兰花叶病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

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江西农业大学学报 2017年第3期39卷 572-580页

作者：梁芳张燕王若斓许申平程喜梅崔波郑州师范学院生物工程研究所河南郑州450044 郑州大学生命科学学院河南郑州450001 郑州拓洋实业有限公司河南郑州450001

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)是引起兰科植物病毒病的最重要病原体。研究根据NCBI上已登录的CyMV外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因保守区设计两对特异性引物,用RT-PCR法从感病蝴蝶兰中克隆到2条CyMV CP基因序列,编码区ORF长... 详细信息

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)是引起兰科植物病毒病的最重要病原体。研究根据NCBI上已登录的CyMV外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因保守区设计两对特异性引物,用RT-PCR法从感病蝴蝶兰中克隆到2条CyMV CP基因序列,编码区ORF长672 bp,编码223个氨基酸。序列分析表明这两个分离物之间有13个核苷酸差异,与已报道的其他地区CyMV分离物CP基因核苷酸相似性分别为97%~99%和97%~98%,氨基酸相似性分别为95%~99%和96%~100%。运用实时荧光定量RT-q PCR法对该病毒检测方法进行了一系列条件优化,建立起一套基于SYBR Green I的CyMV实时荧光定量PCR检测体系。该检测方法比普通RT-PCR法灵敏度高100倍,标准曲线循环阈值(Ct)与模板浓度的对数呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998。重复性试验表明组内及组间变异系数均在2.58%以内,表明该方法重复性较好,可为兰花CyMV的早期预警及病毒在植物体内侵染途径研究提供技术支持。

关键词：建兰花叶病毒实时荧光定量PCR 外壳蛋白基因病毒检测

建兰花叶病毒南京分离物基因组测定与侵染性克隆构建

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南京农业大学学报 2013年第4期36卷 13-17页

作者：张昌伟王静静言燕华韦武青马志虎侯喜林南京农业大学园艺学院江苏南京210095 镇江市蔬菜科学研究所江苏镇江212021

以建兰花叶病毒(CyMV)南京分离物侵染本氏烟的叶片为材料,利用RT-PCR扩增CyMV基因组cDNA,并进行测序,得到全长序列(GenBank登录号:JQ860108),然后插入到pCass4-Rz载体中,构建CyMV侵染性克隆载体。序列分析表明,与已报道的石斛兰、蝴蝶... 详细信息

以建兰花叶病毒(CyMV)南京分离物侵染本氏烟的叶片为材料,利用RT-PCR扩增CyMV基因组cDNA,并进行测序,得到全长序列(GenBank登录号:JQ860108),然后插入到pCass4-Rz载体中,构建CyMV侵染性克隆载体。序列分析表明,与已报道的石斛兰、蝴蝶兰、香草兰分离物序列同源性高达96%以上,并且具有相同的基因组结构;不同国家和地区的序列进化树分析表明,其与我国台湾地区的病毒分离物亲缘关系最近。侵染性克隆通过农杆菌侵染接种本氏烟,与CyMV分离物具有相同的症状,并可利用RT-PCR检测到其外壳蛋白基因,表明成功构建了具有生物活性的CyMV侵染性克隆。

关键词：建兰花叶病毒侵染性克隆载体构建

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒联合免疫胶体金试纸条的研制及应用

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植物保护 2017年第6期43卷 139-143页

作者：于子翔李丽俞禄珍杨翠云吴建祥黄卫昌于翠上海出入境检验检疫局上海200135 上海辰山植物园上海201602 浙江大学生物技术研究所杭州310058

为了实现兰花种植苗圃和口岸一线直接检测样品中建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus(CymMV)和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus(ORSV)的目的,我们研制了上述两种病毒联合免疫胶体金检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体... 详细信息

为了实现兰花种植苗圃和口岸一线直接检测样品中建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus(CymMV)和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus(ORSV)的目的,我们研制了上述两种病毒联合免疫胶体金检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记单抗C10并固定于胶金垫上;将抗体5B7和4F3分别固定于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗鼠抗体包被固定于硝酸纤维素膜上作为质控线,经优化后组装胶体金试纸条。结果表明研制的联合试纸条特异性强,能够在10min之内同时检出两种病毒,操作简便。对两个种植苗圃的93份兰花样品进行实际检测所得结果与ELISA的检测结果符合性好(Kappa值分别为84.6%和86.7%),能满足兰花样品中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的初筛要求。

关键词：建兰花叶病毒齿兰环斑病毒联合免疫胶体金试纸条

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建兰花叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

热带作物学报 2019年第3期40卷 541-545页

作者：樊荣辉黄敏玲钟淮钦罗远华叶秀仙福建省农业科学院作物研究所福建福州350013 福建省农业科学院花卉研究中心福建福州350013 福建省特色花卉工程技术研究中心福建福州350013

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值,建立快速、灵敏的检测方法显得尤为重要。根据CyMV的外壳蛋白基因序列设计4对特异性引物,经过优化反应条件,建立该病毒的RT-LAMP检测方法,并进行LAM... 详细信息

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值,建立快速、灵敏的检测方法显得尤为重要。根据CyMV的外壳蛋白基因序列设计4对特异性引物,经过优化反应条件,建立该病毒的RT-LAMP检测方法,并进行LAMP检测的特异性、敏感性检测。该方法能特异扩增CyMV,与其他4种病毒(齿兰环斑病毒、菜豆黄花叶病毒、黄瓜花叶病毒和小苍兰花叶病毒)不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CyMV,可省去电泳分析的时间。针对CyMV建立的RT-LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点,适用于在进境检疫及种苗繁育过程中的检测鉴定。

关键词：建兰花叶病毒 RT-LAMP 检测

建兰花叶病毒厦门分离物的提纯及RT-PCR检测

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植物保护 2006年第1期32卷 101-103页

作者：明艳林郑国华福建厦门华侨亚热带植物引种园农作物国外引种国家隔离检疫基地厦门361002

以蔓陀罗为建兰花叶病毒(CyMV)厦门分离物的繁殖寄主,通过一次差速离心、一次PEG沉淀结合超速离心提纯建兰花叶病毒,病毒得率约400 mg/kg。根据已经报道的建兰花叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,分别以该病毒RNA及病叶总RNA为模板,建立... 详细信息

以蔓陀罗为建兰花叶病毒(CyMV)厦门分离物的繁殖寄主,通过一次差速离心、一次PEG沉淀结合超速离心提纯建兰花叶病毒,病毒得率约400 mg/kg。根据已经报道的建兰花叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,分别以该病毒RNA及病叶总RNA为模板,建立了建兰花叶病毒RT-PCR快速检测体系,其检测灵敏度可达1.8 pg病毒和11 mg/mL的病叶组织。

关键词：植物病理学建兰花叶病毒 RT-PCR 检测